高酮飲食及D-β-羥基丁酸對帕金森病模型的作用及其機制.pdf

1、本課題用6-OHDA損傷制作PD體內和體外模型。在體內模型中，利用Wistar大鼠給予KD預處理；在體外模型中，利用PC12給予KB的主要成分DβHB預處理。應用Nissl染色、免疫組織化學、高效液相色譜、細胞活力測定、倒置顯微鏡觀察、丫啶橙染色、流式細胞計、反轉錄聚合酶鏈式反應和多功能酶標儀等技術，從多巴胺神經元保護、抗凋亡、抗氧化和維持線粒體功能等方面對KD及其主要成分DβHB治療PD的機制進行研究，為KD治療PD的方法探索實驗依據(jù)

2、，為PD的神經保護治療提供可靠的理論基礎。本實驗分為5部分，第一部分 KID對黑質多巴胺神經元的保護作用 目的：研究KD對大鼠黑質多巴胺神經元的保護作用。 方法：首先給予Wistar大鼠正常飲食和KD預處理2周后，用6-OHDA兩點注射右側紋狀體。實驗共分4組，每組5只：ND組、KD組、6-OHDA+ND組和6-OHDA+KD組。注射6-OHDA后繼續(xù)維持ND或KD處理兩周，用Nissl染色及酪氨酸羥化酶免疫組化染色檢測

3、各組大鼠黑質部位TH陽性神經元數(shù)目的變化，TH免疫組化染色檢測紋狀體TH陽性纖維密度的改變，HPLC檢測紋狀體內DA及其代謝產物3，4-二羥基苯乙酸(dihydroxy-phenylaceticacid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量的變化，分析KD對大鼠黑質多巴胺神經元的保護作用。 結果： 1.Nissl染色及TH免疫組化表明：ND大鼠右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，引起

4、右側黑質部位多巴胺能神經元退變，與未注射6-OHDA的ND大鼠相比較，多巴胺神經元數(shù)目明顯減少，P＜0.01；而給予KD預處理的大鼠，右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，黑質部位多巴胺神經元與6-OHDA+ND組大鼠相比較，數(shù)目明顯增多，P＜0.05；不經6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，黑質部位多巴胺神經元數(shù)目無明顯差別，P＞0.05。TH免疫組化染色表明：ND大鼠右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，引起右側紋狀體部位多巴胺

5、神經元纖維末梢光密度值降低，與未注射6-OHDA的ND組大鼠相比較明顯降低，P＜0.01；而給予KD預處理的大鼠，右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，多巴胺神經元纖維末梢光密度值與6-OHDA+ND組大鼠相比較明顯升高，P＜0.05：不經6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，多巴胺神經元纖維末梢光密度無明顯差別，P＞0.05。 2.HPLC結果表明：ND大鼠右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，引起右側紋狀體內DA及其代謝產物DOP

6、AC和HVA明顯降低，與未注射6-OHDA的ND組大鼠相比較，P＜0.01；而給予KD預處理的大鼠，右側紋狀體內注射6-OHDA兩周后，右側紋狀體內DA及其代謝產物DOPAC與6-OHDA+ND組大鼠相比較明顯升高，P＜0.05，HVA升高，但無明顯差別,P＞0.05；不經6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，右側紋狀體內DA及其代謝產物DOPAC和HVA無明顯差別，P＞0.05。 結論：KD對大鼠黑質多巴胺能神經元的保護

7、作用. 第二部分DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞凋亡的影響 目的：研究DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞凋亡的影響。 方法：首先給予PCI2細胞D13HB(終濃度為4 mM)預處理10 min，然后將6-OHDA(終濃度為50和100μM)加入到體外培養(yǎng)的PC12培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗分為5組：對照組、50μM6-OHDA組、100μM6-OHDA組、4mM DβHB+50μM 6-OHDA

8、組和4mMDβHB+100μM6-OHDA組。用四唑鹽(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)比色法測定各組細胞活力，倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化，AO染色觀察各組細胞凋亡的形態(tài)學改變，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。 結果：經6-OHDA(終濃度為50和100μM)處理的PC12細胞，細胞活力明顯下降，分別為對照組的75.77±0.

9、84％和47.16±2.37％，與對照組相比較，P＜0.01。倒置顯微鏡及AO染色顯示，細胞死亡增加，細胞皺縮，突起變短，呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學變化，上述變化依據(jù)6-OHDA濃度變化而變化，具有濃度依賴性的特點。流式細胞儀結果表明，細胞凋亡率升高，分別為27.17±2.64％和37.89±2.39％(對照組為1.94±0.52％)，與對照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預處理的PC12細胞經6-OHDA處理24h后，細胞

10、活力升高，分別為對照組的86.62±1.66％和65.74±1.49％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.01。倒置顯微鏡及AO染色顯示，細胞死亡減少，細胞皺縮減輕，突起變長，凋亡程度減輕，流式細胞儀結果表明，細胞凋亡率降低，分別為19.38±3.20％和33.24±2.32％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結論：DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞凋亡有抑制作用。 第三部分 DβHB對6-O

11、HDA引起的PC12細胞bcl-2/bax mRNA表達及caspase-3活性變化的影響 目的：研究DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞bcl-2/bax mRNA表達及caspase-3活性變化的影響。 方法：細胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。用RT-PCR方法檢測bcl-2mRNA和bax mRNA表達情況并計算bcl-2/bax mRNA比值，用多功能酶標儀檢測caspase-3活性的變化。 結果：

12、半定量RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了bcl-2 mRNA表達降低，bax mRNA表達升高，bcl-2/bax mRNA比值降低，與對照組相比較，P＜0.05。caspase-3活性升高，為對照組的125.83±1.54％和146.27±2.41％，與對照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預處理的PC12細胞經6-OHDA處理24h后，bcl-2 mRNA升高，baxmRNA

13、降低，bcl-2/bax mRNA比值升高，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05。caspase-3活性降低，為對照組的115.61±2.75％和132.75±3.11％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結論：6-OHDA引起了PC12細胞bcl-2/bax mRNA比值表達降低，caspase-3活性升高，DβHB對上述變化具有抑制作用。 第四部分DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞氧化應激

14、的影響 目的：觀察DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞氧化應激的影響。 方法：細胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。用多功能酶標儀檢測檢測細胞內ROS、MDA和細胞內GSH含量的變化。 結果：6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了PC12細胞內ROS升高，分別為對照組的167.69±9.40％和289.8±9.42％，與對照組相比較，P＜0.05；MDA升高，分別為對照組的201.24±9.68％和29

15、1.18±17.59％，與對照組相比較，P＜0.05：細胞內GSH降低，分別為對照組的75.45±4.97％和53.98±3.20％，與對照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預處理的PC12細胞經6-OHDA處理24h后，細胞內ROS降低，分別為對照組的155.57±6.32％和275.53±8.28％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05；MDA降低，分別為對照組的156.33±9.07％和220.37±1

16、9.81％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05：細胞內GSH升高，分別為對照組的82.29±0.78％和61.01±4.36％，與相對應的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結論：DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞氧化應激具有抑制作用。 第五部分DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞線粒體功能障礙的影響 目的：觀察DβHB對6-OHDA引起的PC12細胞線粒體功能障礙的影響。 方法：細

17、胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。多功能酶標儀檢測線粒體膜電位和ATP水平變化情況。 結果：6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了PC12細胞線粒體膜電位明顯下降，為對照組的78.81±2.96％和42.01±2.95％，具有濃度依賴性，與對照組相比較，P＜0.05;ATP生成減少，為對照組的62.23±4.46％和32.2±4.37％，具有濃度依賴性，與對照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預處理1