回藥扎里奴思方對腦缺血再灌注痰熱腑實模型大鼠神經(jīng)保護作用及炎性級聯(lián)反應(yīng)的影響.pdf

1、腦梗死造成的神經(jīng)功能損害對人類的健康有著嚴重的影響，使患者出現(xiàn)殘疾的幾率已位居第一，病死率位居第三，僅低于癌癥和心肌梗死。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計在每年大約有1500萬患有腦血管相關(guān)疾病，缺血性腦血管病是其發(fā)病率的4/5。腦梗死的患病已經(jīng)逐漸年輕化，其復(fù)發(fā)、致殘和死亡的機率均較高，不但使患者的生活質(zhì)量下降，也給家庭和社會造成了沉重的負擔，給我國醫(yī)療衛(wèi)生產(chǎn)生了巨大壓力。腦部血流減少后，腦組織會產(chǎn)生一系列炎性級聯(lián)效應(yīng)，包括炎癥因子的表達、氨基酸毒

2、性的興奮、神經(jīng)元細胞死亡、周圍去極化四個不同的機制，且各機制在發(fā)生時間上可相互影響、互成因果。其中炎癥反應(yīng)是損傷級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生過程中氧自由基、細胞因子及促炎酶共同促發(fā)的結(jié)果。細胞因子既可通過作用于內(nèi)皮細胞，將受體激活，從而使白細胞進入腦內(nèi)，又可以直接刺激小膠質(zhì)或星形膠質(zhì)細胞釋放有害成分，最終形成腦損傷。病與證結(jié)合既體現(xiàn)了中醫(yī)的基本理論，又結(jié)合了西醫(yī)學(xué)理論與動物實驗學(xué)的知識，運用西醫(yī)學(xué)的病因理論制備了動物的疾病，同時將中醫(yī)的證候建立在疾病的

3、模型中，使動物模型中的證候與疾病相融合，使其具有較好的穩(wěn)定性和可靠性，并且可以動態(tài)的分階段的、系統(tǒng)的進行觀察與研究，因此病證結(jié)合動物模型的研究已成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究模式的一個重要發(fā)展趨勢，對腦梗死的疾病發(fā)病機制及用藥探索有著重大的實際應(yīng)用意義。
　　目的：
　　1.通過檢測痰熱腑實腦缺血再灌注模型大鼠血脂血糖等指標，明確腦缺血痰熱腑實模型應(yīng)激性代謝功能的變化，觀察扎里奴思方對腦梗死代謝功能紊亂的調(diào)節(jié)作用。
　　2.通過觀

4、察腦缺血再灌注后痰熱腑實型大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)元細胞的病理變化，明確扎里奴思方對神經(jīng)細胞的保護作用。
　　3.通過觀察腦缺血再灌注痰熱腑實型模型大鼠經(jīng)再灌注后炎性相關(guān)因子表達的情況，從扎里奴思方對其變化的影響，明確其可能的作用機制；
　　方法：
　　Sprague Dawley大鼠，雄性，250只，SPF級，將其隨機分為正常組、假手術(shù)組、單純腦梗死組、痰熱腑實組、尼莫地平組、扎里奴思方組共六個組，其中正常組10只，其余各

5、組分為1天、3天、7天3個取材時間點每個時間點15只大鼠；正常組、假手術(shù)組、單純腦梗死組給予生理鹽水灌胃，其余各組大鼠通過藥物灌胃制備痰熱腑實證候模型，痰熱腑實模型完成后行大腦中動脈阻塞(MCAO)手術(shù)，術(shù)后2小時進行缺血再灌注；對模型大鼠的宏觀表現(xiàn)進行觀察，對大鼠的神經(jīng)功能采用Longa5級4分法進行評分，大鼠腦組織神經(jīng)元細胞采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eeosin staining-HE)染色法觀察；檢測模型大

6、鼠總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、血糖(glucose,GLU）、低密度脂蛋白(low- densitylipoprotein,LDL)等能量代謝指標的變化；運用免疫組化測定各取材點缺血側(cè)腦組織中TNF-α、白介素6、VCAM-1、ICAM-1陽性細胞數(shù)，實時熒光定量（Real-time PCR，RT-PCR）法測定各因子mRNA的表達，探討扎里奴思方對痰熱腑實腦缺血模型

7、大鼠炎性級聯(lián)反應(yīng)及能量代謝的影響及其神經(jīng)保護機制。
　　結(jié)果：
　　1.痰熱腑實模型大鼠在腦缺血再灌注后血脂及血糖等指標的變化及扎里奴思方對其的影響
　　相比正常組，單純腦梗死組大鼠甘油三酯、血糖均有顯著的增高（P＜0.05）；痰熱腑實模型組大鼠血糖較假手術(shù)組和單純腦梗死組升高（P＜0.05)；總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白相比假手術(shù)組明顯上升（P＜0.05)；與痰熱腑實1天組比較，尼平組TC、TG、LDL-C顯著降

8、低（P＜0.05)；痰熱腑實3天組比較尼莫地平3天組TC、TG、LDL-C差異顯著（P＜0.05)；扎方組1天、3天、7天組與痰熱腑實組相比TC、TG、LDL-C均有顯著降低（P＜0.05)；HDL-C有明顯的升高（P＜0.05)；GLU在尼平組和扎方組3天、7天時顯著減少（P＜0.05)。
　　2.痰熱腑實腦缺血模型大鼠再灌注后神經(jīng)細胞損傷及扎里奴思方的保護作用
　　假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)評分升高的表現(xiàn)，經(jīng)過MCAO手術(shù)后的大

9、鼠較假手術(shù)組和正常組相比，神經(jīng)功能評分明顯升高；單純腦梗死組及痰熱腑實組大鼠與假手術(shù)組相比，1天、3天、7天的神經(jīng)功能評分均明顯升高（P＜0.01)，尤以1天組大鼠上升最為明顯，且痰熱腑實模型組神經(jīng)功能缺損較單純腦梗死組明顯；給藥后，扎里奴思方組和尼莫地平組大鼠在各時間點神經(jīng)功能評分均開始降低，并隨給藥時間延長，評分下降明顯（P＜0.05）；尼莫地平組神經(jīng)功能評分較扎里奴思方組略高。
　　3.痰熱腑實模型大鼠腦缺血再灌注后腦組織神

10、經(jīng)元細胞形態(tài)的改變及扎里奴思方對其的影響
　　扎里奴思方對痰熱腑實腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦細胞的影響：HE染色結(jié)果顯示，與單純腦梗死組相比，假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)排列整齊，胞體、核仁清晰，染色均勻,神經(jīng)元細胞排列緊密；模型組海馬組織細胞結(jié)構(gòu)松散，排列散亂，神經(jīng)元細胞消失較多，部分神經(jīng)細胞胞核變小，細胞間質(zhì)內(nèi)可見大小不等的空泡，細胞核深染且核仁消失，皺縮，界限不清，大部分有退形性改變，神經(jīng)細胞有嗜酸性改變；扎方組和尼平組神經(jīng)細胞排列稍

11、亂，仍可見細胞固縮，其周邊可見神經(jīng)細胞輕度腫脹，胞漿、胞膜、胞核尚能分清，程度較模型組明顯減輕，扎方組較尼莫地平組改善明顯。
　　4.痰熱腑實模型大鼠腦缺血再灌注后炎癥因子的表達及扎里奴思方對其的影響
　　4.1.扎里奴思方對TNF-α表達的影響
　　TNF-α在假手術(shù)組中表達較少，單純腦梗死組與假手術(shù)組相比陽性細胞數(shù)增多明顯（P＜0.01)；隨著時間的延長，TNF-α陽性細胞數(shù)呈下降趨勢，與假手術(shù)組相比仍較高；尼平組

12、與扎方組相對痰熱腑實組來說，TNF-α陽性細胞數(shù)都有所下降（P＜0.01)，以扎里奴思方1d，3d時下降更為明顯（P＜0.05)；模型組各時間點比假手術(shù)組TNF-αmRNA表達升高顯著(P＜0.01)；尼平組和扎方組相比模型組TNF-α mRNA表達降低明顯(P<0.01)；扎里奴思方組較尼莫地平各組TNF-α mRNA表達有所降低，其中扎里奴思方1、7天降低明顯(P<0.05)。
　　4.2.扎里奴思方對IL-6β表達的影響

13、r>　　單純腦梗死組IL-6陽性細胞數(shù)比假手術(shù)組增多明顯（P＜0.05)；扎里奴思方組各時間點與單純腦梗死組及痰熱腑實組比較差異亦均有顯著性（P＜0.05)；與尼平組比較扎方組在1天、3天時均具有顯著差異（P＜0.05)；在假手術(shù)組中IL-6 mRNA表達較低，模型組各時間點相比假手術(shù)組，IL-6 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，在3天時達到高峰；尼莫地平組和扎里奴思方組相比模型各組，IL-6 mRNA表達明顯降低(P<0.01)

14、；扎方各組相比尼平1天、3天、7天組，IL-6 mRNA表達降低明顯（P＜0.05)。
　　4.3.扎里奴思方對ICAM-1表達的影響
　　假手術(shù)組中ICAM-1陽性細胞較少表達，單純腦梗死組相比，假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦組織中陽性細胞表達升高明顯（P＜0.01)；在術(shù)后1天表達最多，扎方組與尼平組大鼠缺血側(cè)腦組織中陽性細胞表達減少且與模型組各組相比差異明顯（P＜0.01)；扎方組相比尼平組，在1天、3天時減少明顯；腦缺血后1天

15、、3天、7天，模型組ICAM-1 mRNA的表達明顯升高，3天后開始減少（P＜0.01)；痰熱腑實組在7天時較單純腦梗死組表達稍有增多；扎方各組和尼平各組與非給藥組比較，ICAM-1 mRNA的表達都明顯降低，（P＜0.01，P＜0.05）；扎方各組與尼平1天、3天、7天組比較ICAM-1 mRNA表達降低明顯（P＜0.05）。
　　4.4.扎里奴思方對VCAM-1表達的影響
　　假手術(shù)組中VCAM-1陽性細胞表達較少，單純

16、腦梗死組與假手術(shù)組相比，各時間點VCAM-1細胞陽性表達明顯增多(P<0.05)；扎方組和尼莫地平組各時間點VCAM-1細胞陽性表達明顯減少(P<0.05)；扎里奴思方與尼莫地平組相比，1天組VCAM-1細胞陽性表達降低尤其顯著(P<0.05)；VCAM-1 mRNA在假手術(shù)組中已有少量表達，模型組各時間點假手術(shù)組相比，VCAM-1 mRNA顯著升高(P<0.01)；相比非用藥組，扎方組和尼平組VCAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0

17、.01，P<0.05)；扎方各組相比尼平1天、3天、7天組VCAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.痰熱腑實模型大鼠在腦缺血再灌注反應(yīng)后應(yīng)激性出現(xiàn)血糖、TG、膽固醇、LDL的升高，HDL的降低，應(yīng)用扎里奴思方后大鼠血糖及血脂水平均有不同程度的改善，說明其對梗死后脂質(zhì)的代謝有促進作用。
　　2.痰熱腑實模型大鼠在腦缺血損傷后神經(jīng)細胞出現(xiàn)不同程度的損傷并表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺失癥狀，扎里奴思方可促