經(jīng)動脈灌注地塞米松對大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、腦卒中是人類致殘、致死的主要病因之一。在我國，腦卒中是第一位的致死因素，2013年的數(shù)據(jù)表明:中風造成我國70歲以上人群200萬人的死亡，而在49歲以下人群，中風也是導致死亡的主要原因之一。急性缺血性卒中是最多見的卒中類型，約占患者總數(shù)的80％。腦缺血后會引發(fā)一系列的病理生理及生化反應，如乳酸堆積、自由基釋放、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸中毒、炎性過程及凋亡等，稱為腦缺血的瀑布級聯(lián)反應。其中炎性反應在腦缺血損傷的發(fā)展過程中的扮演著重要角色

2、。腦缺血誘導炎性因子大量產(chǎn)生，引起急性炎癥反應，加重患者腦損害。
　　糖皮質(zhì)激素類藥物具有快速而強大的抗炎作用。既往的動物實驗表明，糖皮質(zhì)激素類藥物可以降低腦缺血所致的腦損害，是一種潛在的神經(jīng)保護劑。早期的臨床實驗也證實應用糖皮質(zhì)激素類藥物能夠降低缺血性卒中患者的死亡率，改善患者神經(jīng)功能。然而，在此后的多個臨床實驗中，糖皮質(zhì)激素類藥物未表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，甚至有實驗發(fā)現(xiàn)，生理劑量糖皮質(zhì)激素會加重腦缺血大鼠的神經(jīng)損害。目前，對于糖皮

3、質(zhì)激素類藥物在缺血性卒中治療上的價值存在爭議。
　　分析既往實驗發(fā)現(xiàn):大劑量糖皮質(zhì)激素類藥物對腦缺血多具有顯著的治療作用，而生理劑量則多無效，甚至加重神經(jīng)損害;治療有效的實驗，給藥時間多在腦缺血之前或缺血后立即給藥。由此推測:糖皮質(zhì)激素類藥物對腦缺血的治療作用呈明顯的時間-劑量依賴關系，即梗死早期大劑量糖皮質(zhì)激素類藥物治療能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護作用。本研究利用大鼠大腦中動脈閉塞模型，給予大劑量地塞米松，對地塞米松治療缺血性卒中的時

4、間依賴性及其機制進行了探討。
　　大劑量地塞米松治療會造成藥物副作用的增加，而嚴格的治療時間窗必然會限制藥物的臨床應用。與傳統(tǒng)的經(jīng)靜脈給藥相比，經(jīng)動脈給藥治療，藥物直達病變組織，不經(jīng)肝臟代謝，避免了藥物的“首過效應”，不但可以獲得更高的局部藥物濃度，并且由于藥物作用集中在給藥部位，減少了藥物的全身毒、副作用。再者，由于藥物直達病變部位，避免了藥物經(jīng)血液循環(huán)到達病變部位的時間延遲，經(jīng)動脈給藥縮短了藥物在局部達到治療濃度所需的時間，為

5、缺血性卒中的治療爭取了寶貴的“時間窗”。經(jīng)動脈藥物灌注可以很好地解決地塞米松的治療劑量大和治療時間窗狹窄的問題。在進一步的研究中，利用改進的經(jīng)動脈藥物灌注方法，探究了經(jīng)動脈地塞米松灌注對地塞米松治療時間窗和治療劑量的影響。
　　第一部分 大鼠大腦中動脈閉塞模型基礎上的經(jīng)動脈藥物灌注方法改進
　　目的:改進經(jīng)動脈藥物傳輸方法，建立適用于經(jīng)動脈藥物灌注研究的大鼠缺血性卒中模型。
　　方法:經(jīng)動脈藥物灌注微管裝置的制作:用環(huán)

6、氧化物膠包裹的1mm長的尼龍線（外徑:0.181 mm）堵塞的PE-0402管（長約50mm）的一端。在距離PE-0402管被堵塞端2mm處的側(cè)壁做1mm長的縱行切口，作為藥物的輸出口。經(jīng)頸外動脈插入微管裝置，使其頭端堵塞到達大腦中動脈開口，在選定的時間點，使用微管裝置，經(jīng)頭端縱行切口向動脈傳輸藥物，使用一個微管裝置，同時達到閉塞大腦中動脈和經(jīng)動脈藥物傳輸?shù)哪康?。為檢驗微管裝置誘導局灶腦缺血的能力，利用廣泛使用的線栓（線栓組）和自制的微

7、管裝置（微管組）分別建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，建模后24h，比較兩組大鼠的神經(jīng)缺損評分和腦梗死的體積。為檢驗改進方法的藥物傳輸能力，對比了原有經(jīng)動脈藥物傳輸方法（PE-10組）與改進方法(microcatheterdevice組)的藥物傳輸效率。大腦中動脈閉塞模型建立后2h，通過不同方法向模型大鼠灌注等量伊文斯藍溶液。灌注后4h，利用分光光度法檢測不同組別大鼠梗死半球的伊文斯藍滲出量。
　　結(jié)果:模型建立后24h，線栓組和微管組

8、大鼠的神經(jīng)缺損評分相當，兩組大鼠腦梗死的體積差別沒有統(tǒng)計學意義。伊文斯藍灌注后4h，microcatheter device組大鼠梗死半球的伊文斯藍的滲出量為35.9±7.7μ g/g，顯著高于PE-10組(17.7±4.4μ g/g)。
　　結(jié)論:1.本研究改進了大鼠大腦中動脈閉塞模型基礎上的經(jīng)動脈藥物灌注方法，使用同一微管裝置同時達到閉塞大鼠大腦中動脈和經(jīng)動脈藥物灌注的目的;2.微管裝置誘導大鼠大腦中動脈閉塞的能力與廣泛使用的

9、線栓相當，其藥物傳輸效能較已有方法更高;3.使用微管裝置的動脈給藥方法造模更簡單、梗死更穩(wěn)定，并且可適用于不同研究策略:藥物傳輸可以在缺血-再灌注之前也可以在缺血-再灌注之后，可以用于缺血-再灌注模型的經(jīng)動脈藥物傳輸研究，也可以用于永久梗死模型的相關研究。
　　第二部分 大劑量地塞米松對大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護作用研究
　　目的:研究大劑量地塞米松對缺血性卒中的治療效果并探索其治療時間窗及機制。
　　方法:線栓

10、法建立大鼠腦缺血-再灌注模型，在建模后不同時間點(30min、60min、120min)，經(jīng)靜脈給予10mg/kg地塞米松。在缺血腦組織再灌注后48h，比較不同組別大鼠的神經(jīng)缺損評分和腦梗死體積，探索大劑量地塞米松治療缺血性卒中的療效及時間依賴性。為進一步探究地塞米松治療缺血性卒中的機制，利用免疫組織化學、Western blot和ELISA等檢測手段，比較了不同時間點(30min、60min)給藥對NF-kB激活及炎性因子（TNF-α

11、、IL-1β、COX-2、iNOS）表達的影響。
　　結(jié)果:30min給藥組大鼠的神經(jīng)缺損評分(1.9±0.7)和梗死體積(20.4±6.1％)，較梗死對照組明顯降低。60min組、120min組大鼠的神經(jīng)缺損評分和梗死體積與梗死對照組相當。免疫組織化學染色的結(jié)果顯示，大腦中動脈閉塞后30min給予大劑量地塞米松，能夠顯著降低海馬區(qū)NF-kB p65的表達。Western blot發(fā)現(xiàn)大腦中動脈閉塞后2h，梗死周邊區(qū)NF-kB p

12、65、p-p65表達量一過性增高，而在大腦中動脈閉塞后30min給予大劑量地塞米松，能夠顯著抑制梗死周邊區(qū)的NF-kB p65、p-p65表達增加，減少炎性因子（COX-2、iNOS）產(chǎn)生。ELISA發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈堵塞后30min給予大劑量地塞米松顯著降低了梗死周邊區(qū)促炎因子（TNF-α、IL-1β）的水平。
　　結(jié)論:1.大劑量地塞米松治療對腦缺血-再灌注大鼠模型有神經(jīng)保護作用，并且具有嚴格的治療時間窗;2.大劑量地塞米松對腦

13、缺血-再灌注大鼠模型的神經(jīng)保護作用與地塞米松抑制NF-kB激活從而減少炎性因子的產(chǎn)生相關。
　　第三部分 經(jīng)動脈灌注地塞米松對大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護作用研究
　　目的:探討經(jīng)動脈給藥對地塞米松的治療劑量和治療時間窗的影響。
　　方法:利用微管裝置建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，分別在模型建立后30min和60min，按照不同劑量（10mg/kg或者2mg/kg），經(jīng)不同方式（經(jīng)靜脈或者經(jīng)動脈）給予地塞米松或安慰劑

14、。腦缺血-再灌注后48h，比較不同組別大鼠的神經(jīng)缺損評分、運動功能（前肢錯誤放置測試、平行棒測試、攀繩測試）及梗死體積。
　　結(jié)果:大腦中動脈閉塞后60min，經(jīng)動脈小劑量地塞米(2mg/kg)松灌注能夠顯著改善腦缺血-再灌注大鼠模型的神經(jīng)缺損評分，提高其運動能力，減小梗死體積。其治療效果與大腦中動脈閉塞后30min，經(jīng)靜脈大劑量地塞米(10mg/kg)治療相當。
　　結(jié)論:經(jīng)動脈地塞米松灌注可以擴展地塞米松治療缺血性卒中的