槲皮素通過調(diào)控SIRT1對快速老化小鼠的神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的:
　　觀察槲皮素對于快速老化癡呆小鼠(SAM)模型海馬組織中的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活水平，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶Ⅰ(SIRT1)蛋白表達水平，過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAR-γ)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白表達水平的作用，以及對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER Stress)的作用和神經(jīng)退行性變的緩解，驗證槲皮素是否能夠通過提高SIRT1水平來改善老年

2、性癡呆的癥狀及病理改變。期望能找到治療神經(jīng)退行性病變的理想方法，為槲皮素的進一步開發(fā)及臨床用藥提供更可靠的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　10只七月齡抗快速老化亞系SAMR1小鼠為正常組，給予含0.1％ DMSO的超純水灌胃，40只雄性快速老化亞系SAMP8小鼠按簡單隨機化分成4個實驗組，分別為模型組（0.1％ DMSO的超純水灌胃，10只）、槲皮素低劑量組（口服給藥25mg/kg/天，10只），槲皮素高劑量組（口服給藥50mg

3、/kg/天，10只），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal組（腹腔注射給藥1mg/kg/天，10只）。
　　灌胃四周后，通過Morris水迷宮行為動物學(xué)實驗檢測SAMR1和SAMP8認知記憶能力。Western-blot法檢測小鼠海馬組織中BIP，eIF2α，p-eIF2α，CHOP，SIRT1,AMPK，p-AMPK，PPAR-γ，BDNF蛋白表達水平。試劑盒檢測小鼠海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA，ROS;H&E染色觀察大腦基

4、本形態(tài)，尼氏染色觀察神經(jīng)椎體細胞。實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±Sx)和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示，統(tǒng)計學(xué)計算使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包協(xié)助完成，所有計量資料均采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。
　　成果:
　　(1) Morris水迷宮行為學(xué)測試
　　在定位航行試驗中，與對照組相比，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P＜0.01);與模型組相比，槲皮素高劑量組小鼠定位航行測試中逃避潛伏期均顯著縮短(

5、P＜0.01);槲皮素低劑量組小鼠逃避潛伏期有明顯縮短，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　在空間探索試驗中，與對照組相比，模型組小鼠穿越原平臺位置次數(shù)明顯減少(P＜0.01);與模型組相比，槲皮素低、高劑量用藥組小鼠穿越原平臺位置次數(shù)都有增多(P＜0.01，P＜0.05)。與對照組相比，模型組小鼠在原平臺象限停留時間有增加（P＜0.01）;與模型組相比，槲皮素低、高劑量組小鼠在原平臺象限停留時間都有延長(P＜0.01，P＜0.01)。

6、r>　　(2) Western-blot法檢測小鼠海馬中BIP，eIF2α，p-eIF2α，CHOP，SIRT1,AMPK，p-AMPK，PPAR-γ，BDNF蛋白水平。
　　Western blot實驗結(jié)果顯示，槲皮素可以增加SAMP8小鼠海馬中的SIRT1，PPAR-γ，BDNF和AMPK磷酸化的表達，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。與對照組相比，模型組SIRT1，PPAR-γ，BDNF和AMPK磷酸化的表達明顯減少，與模型組相比，槲皮素低劑

7、量組和高劑量組均可以提高SIRT1，PPAR-γ，BDNF和AMPK磷酸化的表達。
　　槲皮素對于SAMP8老化小鼠大腦海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的WB結(jié)果顯示:槲皮素對于SAMP8老化小鼠大腦海馬組織BIP蛋白濃度影響的WB結(jié)果中，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中BIP蛋白水平較高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;槲皮素低、高劑量組、SAL陽性藥組較模型組BIP蛋白水平顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。槲皮素對于SA

8、MP8老化小鼠大腦海馬組織eIF2α的磷酸化水平表達影響的WB結(jié)果。與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中eIF2α的磷酸化水平顯著較高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;槲皮素低、高劑量組、SAL陽性藥組較模型組eIF2α的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中CHOP蛋白濃度水平顯著較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;槲皮素高劑量組、SAL陽性藥組較模型組

9、CHOP蛋白濃度水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05）;槲皮素低劑量組較模型組CHOP蛋白濃度水平有所降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3)試劑盒檢測小鼠海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)
　　MDA測定水平:與正常對照組比較，模型組MDA水平明顯增加（P＜0.01）;與模型組比較，槲皮素低、高劑量組MDA水平明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。
　　ROS測定水平:與正常對照組比較，模型組ROS水平明

10、顯增加(P＜0.01);與模型組比較，槲皮素低、高劑量組ROS水平明顯減少(P＜0.01，P＜0.01)。
　　(4)組織形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果
　　尼式染色結(jié)果顯示:與對照組相比，模型組中SAMP8模型小鼠大腦CA1區(qū)細胞死亡（黑色箭頭標(biāo)記）和凋亡小體（紅色箭頭標(biāo)記）的數(shù)量增加;槲皮素會保護SAMP8模型小鼠大腦CA1區(qū)的神經(jīng)細胞損傷。詳細來看，模型組小鼠在海馬的CA1區(qū)域中錐體細胞層的厚度和健康神經(jīng)元細胞的密度減少，槲皮素給藥可

11、預(yù)防SAMP8小鼠腦中的神經(jīng)元損傷。
　　HE染色用以檢測SAMR1和SAMP8小鼠大腦海馬的病理變化顯示:如圖所示，HE染色之后，小鼠海馬神經(jīng)元細胞核染成藍紫色，細胞質(zhì)呈現(xiàn)為粉紅色或淡紅色。與對照組相比，在模型組小鼠海馬形態(tài)學(xué)損傷變化明顯，如海馬神經(jīng)元腫脹、變性，核固縮或消失，在CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列紊亂。經(jīng)過槲皮素給藥之后，SAMP8小鼠腦海馬CA1區(qū)有所改善，正常錐體細胞數(shù)量增多，焦點邊界清晰、規(guī)律。
　　結(jié)論: