ART1對小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機制探討.pdf

1、目的:探討精氨酸特異性腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶1（Arginine-specific ADP ribosyltransferase-1，ART1）基因表達(dá)對小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞生長增殖的影響和相關(guān)機制。
　　 方法:細(xì)胞免疫熒光法檢測ART1水平，以證實CT26細(xì)胞中有ART1的表達(dá)。以 ART1-shRNA、NC-shRNA(Negativecontrol-shRNA，NC-shRNA)、ART1過表達(dá)三種慢病毒顆粒感染CT

2、26細(xì)胞，以NC-shRNA組和未轉(zhuǎn)染組作為對照組。采用RT-PCR和Western blot檢測四組細(xì)胞ART1 mRNA和ART1蛋白的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光法觀察四組細(xì)胞中ART1表達(dá)的差異;CCK-8(cell countingkit-8)法分析各組細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞周期分布。構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，觀察各組移植瘤的生長狀況（體積、重量）和小鼠存活時間，Western blot檢測移植瘤組織中ART1蛋白表達(dá)水平

3、的變化。Western blot檢測各組細(xì)胞及移植瘤組織中RhoA和下游因子c-myc、c-fos及COX-2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.CT26細(xì)胞中有ART1的表達(dá)。
　　 2.三種慢病毒成功感染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定的相應(yīng)CT26細(xì)胞株。
　　 3.RT-PCR和western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，在ART1-shRNA組CT26細(xì)胞中，ART1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0

4、.05)，而在ART1過表達(dá)組CT26細(xì)胞中顯著增高(P＜0.05)，NC-shRNA組和未感染組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，ART1在ART1-shRNA組的CT26細(xì)胞中幾乎無表達(dá)，其平均熒光強度值（17.35±2.01）顯著小于對照組(P＜0.05)，在ART1過表達(dá)組中有強烈的表達(dá)且高于對照組(61.41±3.51)(P＜0.05)。
　　 5.CCK8法結(jié)果顯示， ART1-

5、shRNA組中CT26細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于對照組(P＜0.05)，ART1過表達(dá)組CT26細(xì)胞增殖抑制率顯著低于未感染組(P＜0.05)。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照相比較，ART1-shRNA組CT26細(xì)胞分裂各個時期細(xì)胞百分率產(chǎn)生了顯著的變化，G2期和S期明顯降低、細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低(P＜0.05); ART1過表達(dá)組CT26細(xì)胞則相反，G2期和S期顯著增高、細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增高(P＜0.05)。
　　

6、 7.在動物皮下移植瘤模型中，各組移植瘤的生長狀況顯示，與對照組移植瘤的體積和重量數(shù)據(jù)相比較，ART1-shRNA組明顯減小(P＜0.05)，ART1過表達(dá)組明顯增大(P＜0.05);荷瘤小鼠存活狀況結(jié)果表明，ART1-shRNA組小鼠平均存活時間較對照組明顯延長(P＜0.05)，ART1過表達(dá)組明顯縮短(P＜0.05)。
　　 8.移植瘤組織進(jìn)行western blot檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組中ART1蛋白的表達(dá)比較，ART1-

7、shRNA組中的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，ART1過表達(dá)組明顯升高(P＜0.05)。各組細(xì)胞和移植瘤組織中RhoA、c-myc、c-fos和COX-2蛋白的western blot檢測結(jié)果顯示，ART1-shRNA組各因子的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，ART1過表達(dá)組明顯升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:干擾和促進(jìn)ART1表達(dá)分別可以抑制和促進(jìn)CT26細(xì)胞增殖，提示ART1在腫瘤生長增殖過程中發(fā)揮重要作用。其機制可能與改