Leptin-LepRb和炎性細(xì)胞因子在高脂飲食合并CUMS致抑郁障礙中的作用.pdf

1、肥胖是由于環(huán)境和遺傳等因素造成的機(jī)體脂肪過度累積狀態(tài)，易并發(fā)糖尿病、冠心病和呼吸窘迫綜合征等多種生理疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，世界范圍內(nèi)肥胖的發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。抑郁是一種以顯著而持續(xù)的情緒低落、思維遲緩和言語減少為主要特征的情緒障礙性疾病，伴有快感缺乏和認(rèn)知功能損害。世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測2020年抑郁癥將在全球重大非致命性疾病中位居第二。抑郁情緒容易伴發(fā)糖尿病等代謝相關(guān)性疾病，危害患者的身

2、心健康、生活及工作能力，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肥胖人群抑郁癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。由于抑郁情緒導(dǎo)致的社會(huì)功能下降伴隨著運(yùn)動(dòng)量減少，抑郁患者的肥胖發(fā)生率也高于普通人群。另有研究提示抑郁癥和肥胖存在相同的候選基因。抑郁和肥胖共病嚴(yán)重危害患者的健康狀況，導(dǎo)致不良的結(jié)局。
　　瘦素(Leptin)是一種由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素，發(fā)揮抑制食欲、降低能量攝取、增加能量消耗和抑制脂肪組織合成的作用，其生理功能主要是通過

3、受體b(Leptin receptorb，LepRb)介導(dǎo)。肥胖人群由于中樞/血漿瘦素比例降低導(dǎo)致外周瘦素水平升高而中樞瘦素作用減弱稱之為瘦素抵抗現(xiàn)象。近年有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在不同程度的瘦素水平的改變，如體重正常的抑郁癥患者血漿瘦素水平升高，女性抑郁癥患者的血漿瘦素降低，瘦素與抑郁癥狀的相互影響受腹部肥胖程度的調(diào)節(jié)。海馬區(qū)域LepRb的缺失可引起抑郁樣行為表現(xiàn)，而腦內(nèi)注射瘦素具有抗抑郁的效果。這些研究提示瘦素作為一種內(nèi)分泌激素，在

4、調(diào)節(jié)能量攝入和代謝的同時(shí)，可能在抑郁、焦慮樣行為的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。但瘦素在肥胖與抑郁共病中的機(jī)制尚不清楚。
　　肥胖導(dǎo)致機(jī)體長期處于低度炎癥狀態(tài)，伴有炎性細(xì)胞因子的分泌升高和脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤，而免疫介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)是導(dǎo)致肥胖的重要原因之一。腦內(nèi)細(xì)胞因子與神經(jīng)元的完整性密切相關(guān)，在神經(jīng)突觸重塑方面具有重要作用，且影響神經(jīng)環(huán)路和神經(jīng)遞質(zhì)功能。研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子升高導(dǎo)致快感缺乏、厭食、發(fā)熱、睡眠的變化和社會(huì)能力下降等抑郁樣行

5、為。炎性細(xì)胞因子的持續(xù)升高會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的功能從而導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙如抑郁癥。局部注射細(xì)胞因子可以使動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀和與抑郁癥行為改變。最近更有學(xué)者指出，肥胖時(shí)的游離脂肪酸可通過TLR4信號(hào)通路升高炎性細(xì)胞因子的水平。在炎性細(xì)胞因子中，IL-1β、IL-6和TNF-α被認(rèn)為是介導(dǎo)抑郁樣行為和認(rèn)知功能損害的關(guān)鍵因子。NF-κB是TLR通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，同時(shí)也是影響壓力性精神失調(diào)和抑郁癥的調(diào)節(jié)因子。但炎性細(xì)胞因子在肥胖和抑郁共病中的作用

6、尚沒有系統(tǒng)的研究。
　　高能量食物的過量攝入是導(dǎo)致肥胖的重要因素，因此高脂飲食(High-fat-diet，HFD)飼養(yǎng)是常用的建立肥胖動(dòng)物模型的方法。同時(shí)，慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)模式可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)快感缺失和對新奇環(huán)境的探索能力下降等抑郁焦慮樣癥狀，是一種建立抑郁動(dòng)物模型的有效方法。本研究旨在以高脂飲食誘導(dǎo)肥胖后，聯(lián)合應(yīng)用高脂飲食和慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)

7、激建立肥胖與抑郁癥共病的動(dòng)物模型，采用行為學(xué)測試評(píng)估動(dòng)物模型的表觀效度，進(jìn)而檢測血漿Leptin、中樞LepRb、中樞IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB蛋白水平和mRNA水平，闡明Leptin/LepRb和炎性細(xì)胞因子在高脂飲食和慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激誘導(dǎo)的肥胖和抑郁共病中的作用。
　　1.研究目的
　　(1)高脂飲食與慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激構(gòu)建的肥胖和抑郁共病大鼠的表觀效度。
　　(2) Leptin/Le

8、pRb在肥胖和抑郁共病大鼠的抑郁、焦慮樣行為和認(rèn)知功能損害中的作用。
　　(3)下丘腦和前額葉IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB在肥胖和抑郁共病大鼠抑郁、焦慮樣行為和認(rèn)知功能損害中的作用。
　　2.材料和方法
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組68只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，根據(jù)體重隨機(jī)分為兩組。正常對照組24只(Regular diet，RD)，高脂飼料組44只。第8周末，將高脂飼料組大鼠體重與對照組平均體重進(jìn)行比較

9、，其中26只高脂飼料組大鼠判定為飲食誘導(dǎo)肥胖（Diet-induced obesity, DIO）大鼠。第9周開始，24只RD組大鼠和26只DIO大鼠被各自隨機(jī)分為兩組，其中1組接受21天的慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激。因此，本研究包括四組:對照組(Ctr，n=12)，CUMS組(CUMS，n=12)，單純肥胖組(Ob，n=13)，肥胖合并CUMS組(Co，n=13)。
　　(2)慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激每只大鼠均單籠孤養(yǎng)。刺激方式包括:

10、禁食8h，禁水8h，45°斜籠，群養(yǎng)，晝夜節(jié)律顛倒，浸濕鼠籠，水平搖晃20min。每天隨機(jī)采用一種方法刺激大鼠，每種方法不出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)，整個(gè)過程持續(xù)3周。
　　(3)行為學(xué)測試抑郁樣行為如快感缺乏和探索能力的下降使用糖水偏好試驗(yàn)(Sucrose preference test，SPT)和曠場試驗(yàn)(Open field test，OPT)來評(píng)估，焦慮樣行為通過高架十字迷宮測試(Elevated plus maze test，EPT)

11、來評(píng)估，空間學(xué)習(xí)記憶損害采用Morris水迷宮試驗(yàn)（Morris water maze，MWM）進(jìn)行檢測。
　　(4)體重和脂肪/體重比測定每周固定時(shí)間測量一次大鼠體重。脂肪/體重比(％)=[腹膜后脂肪(g)+網(wǎng)膜脂肪(g)+附睪臘肪(g)]/體重(g)×100％。
　　(5)血生化檢測使用LX-20型全自動(dòng)生化分析儀測定大鼠總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平。
　　(6) Elisa檢測采用大鼠瘦素E

12、lisa試劑盒測定血漿瘦素濃度，大鼠IL-1β、IL-6、TNF-αt和NF-κB Elisa試劑盒測定海馬和前額葉區(qū)域腦組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)。
　　(7)免疫組織化學(xué)檢測LepRb表達(dá)將石蠟包埋腦組織冠狀方向切成厚度為5μm薄片，采用免疫組化染色方法檢測海馬和下丘腦區(qū)域的LepRb表達(dá)，陽性細(xì)胞顯示棕黃色顆粒，高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　(8)免疫印跡檢測LepRb表達(dá)分別取30mg海馬和下丘腦冰上勻漿后離

13、心，取上清液測定蛋白濃度，每個(gè)樣品取等量的蛋白，用12％的SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂牛奶緩沖1小時(shí)，然后加入一抗4℃過夜。次日洗滌三次后，加入二抗室溫條件下孵育1小時(shí)，隨后加入增強(qiáng)發(fā)光液顯影。條帶的光密度使用c-digit記錄和分析。
　　(9)實(shí)時(shí)定量PCR檢測海馬、下丘腦LepRb和海馬、前額葉IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB表達(dá)用Trizol從組織中提取總RNA，用標(biāo)準(zhǔn)試劑和程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)

14、定量PCR。使用96孔板20μL反應(yīng)體系，95℃/5min，以下條件運(yùn)行40個(gè)周期:95℃/30s，60℃/30s，72℃/30s，終止在72℃/5min。所有PCR數(shù)據(jù)分析利用2-ΔΔCT方法。
　　3.結(jié)果
　　(1)11周高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致大鼠體重、體脂比和血脂增加，3周的慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激降低大鼠的體重和體脂比，肥胖合并CUMS組大鼠的體重和體脂比高于對照組和CUMS組而低于單純肥胖組。
　　(2)高脂飲食與慢性

15、輕度不可預(yù)期性應(yīng)激聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致大鼠在糖水偏好試驗(yàn)、曠場試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)出焦慮抑郁樣行為，并在Morris水迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)出認(rèn)知記憶功能障礙。
　　(3)高脂飲食與慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用均導(dǎo)致大鼠血漿Leptin升高，海馬和下丘腦區(qū)域LepRb表達(dá)下降。糖水偏好，曠場試驗(yàn)跨格數(shù)目、高架十字迷宮開放臂時(shí)間百分比以及Morris水迷宮目標(biāo)象限時(shí)間百分比與海馬和下丘腦區(qū)域的LepRb蛋白水平均呈顯著負(fù)相關(guān)。

16、>　　(4)高脂飲食與慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用均導(dǎo)致大鼠下丘腦和前額葉IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB升高，糖水偏好，曠場試驗(yàn)跨格數(shù)目、高架十字迷宮開放臂時(shí)間百分比以及Morris水迷宮目標(biāo)象限時(shí)間百分比與海馬和前額葉區(qū)域的IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB蛋白水平均呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　4.結(jié)論
　　(1)慢性輕度不可預(yù)期性應(yīng)激可能對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖有逆轉(zhuǎn)作用。
　　(2)高脂喂養(yǎng)和