不同模式死亡細胞對巨噬細胞分泌炎性細胞因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、細胞死亡是多細胞生物的重要生命過程之一，在生物體的發(fā)育、防御及自穩(wěn)過程中起重要作用。死亡細胞表面表達的特異性標志物如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），使得它們能快速被吞噬細胞所吞噬，并引起相應(yīng)的免疫學事件。吞噬細胞識別的死亡細胞可分為兩種：凋亡細胞和壞死細胞。凋亡（apoptosis）是一種程序化的、需要消耗能量的、不引起組織炎癥反應(yīng)和損傷的細胞死亡過程，壞死是（necrosis）一種非程序化的、不需要消耗能量

2、的、引起組織炎癥反應(yīng)和損傷的細胞死亡過程。近10年的研究證明，兩種不同死亡方式的細胞在自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等過程中均發(fā)揮重要的作用。 對于死亡細胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機制，作者的導師首次提出了“細胞死亡方式”免疫識別理論模型，認為凋亡細胞誘導免疫耐受而壞死細胞誘導免疫應(yīng)答。我們既往的研究表明：凋亡細胞能夠抑制T細胞活化、延長移植物存活并誘導免疫耐受。文獻報導壞死細胞能夠活化免疫系統(tǒng)，增強抗感染能力。但是對于不同方式

3、死亡細胞如何調(diào)控免疫反應(yīng)，尤其是其對吞噬細胞功能的影響仍不清楚。 在革蘭氏陰性細菌感染時會釋放大量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進入血液循環(huán)。已知LPS可以激活巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interlukin-1，IL-1）、白細胞介素6（interlukine-6，IL-6）、白細胞介素8（interlukine-8，IL-8）

4、等多種炎癥介質(zhì)，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥。由于炎癥部位往往同時存在廣泛的細胞壞死和細胞凋亡，那么在細菌感染、細菌代謝產(chǎn)物存在的情況下，壞死細胞或凋亡細胞是否會調(diào)控細菌感染所引起的免疫反應(yīng)呢？為此，我們擬首先通過體外研究，以炎性細胞因子（TNF-α和IL-6）分泌為指標，探討不同方式死亡細胞本身以及在LPS刺激下對吞噬細胞功能的影響。 目的： 研究和比較不同模式死亡細胞被吞噬后對巨噬細胞分泌炎性細胞因子的調(diào)節(jié)作用，并闡明其可

5、能的分子機制，為“細胞死亡方式免疫識別模型”這一假說提供實驗依據(jù)。 方法： 1.小鼠巨噬細胞株RAW264.7的培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞株RAW264.7，由南方醫(yī)科大學病理生理學教研室姜勇教授饋贈，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 2.EL-4細胞的培養(yǎng) 小鼠T淋巴細胞株EL-4，由南方醫(yī)科大學免疫學教研室富寧教授

6、饋贈，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 3.小鼠腹腔巨噬細胞的分離和培養(yǎng) 取6周左右的Balb/c小鼠，腹腔注射1ml無菌液體石蠟，3-4天后放血處死小鼠，無菌PBS反復(fù)灌洗腹腔，吸出滲液，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次后，37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。 4.凋

7、亡和壞死細胞的制備 無菌操作取Balb/c小鼠胸腺并分離淋巴細胞，用完全培養(yǎng)基RPMI-1640調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。 誘導小鼠胸腺細胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，地塞米松（Dexamethasone，Dex）濃度5×106M，孵育時間6h。 誘導EL-4細胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑6cm，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，波長310nm的紫

8、外線（ultraviolet ray，UV）燈管下10cm處照射60min，孵育時間16h。 誘導小鼠胸腺細胞及EL-4細胞壞死條件：無血清RPMI-1640培養(yǎng)基4ml，56℃水浴加熱60min。 收集處理后的細胞檢測凋亡/壞死率，按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒的操作說明書進行。 5.建立巨噬細胞和死亡細胞的共培養(yǎng)模型 在96孔板上種植RAW264.7細胞或小鼠腹腔原代巨噬細胞，分為3組，

9、即對照組、凋亡細胞處理組（凋亡組）和壞死細胞處理組（壞死組）。對于凋亡組和壞死組，將巨噬細胞分別與1：5比率的凋亡/壞死細胞共培養(yǎng)。而對照組以等體積完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 6.建立巨噬細胞與死亡細胞和LPS作用下的共培養(yǎng)模型 在96孔板上種植RAW264.7細胞或小鼠腹腔原代巨噬細胞，分為3組，即對照組、凋亡組和壞死組，凋亡組和壞死組巨噬細胞分別與1：5比率的凋亡/壞死

10、細胞共培養(yǎng)，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基作為空白對照處理。共培養(yǎng)1h后，加入LPS，并調(diào)節(jié)終濃度為100ng/ml，37℃、5%CO2孵箱孵育18h后收集上清，-20℃保存。 7.多細胞因子的檢測 以Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)和小鼠細胞因子檢測試劑盒檢測不同處理組的細胞共培養(yǎng)物上清中細胞因子。 8.統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗，比較實驗組與對

11、照組之間的差異。 結(jié)果： 1.4-6周小鼠胸腺可分離出細胞1-2×108。由于在前期研究中發(fā)現(xiàn)，對于小鼠胸腺淋巴細胞凋亡的誘導，Dex誘導法明顯優(yōu)于UV，因此我們對Dex誘導方法進行了深入探討。發(fā)現(xiàn)影響細胞凋亡的主要因素有：Dex濃度，細胞濃度，孵育時間。對Dex誘導法反復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)制備早期凋亡細胞的最佳條件為：細胞濃度5×106/ml，Dex濃度5×10-6M，孵育時間6h。此條件誘導的凋亡細胞，應(yīng)用流式細胞計數(shù)法得出

12、早期凋亡率（44.512±3.565）%，晚期凋亡率/壞死率晚期凋亡細胞數(shù)為（8.753±3.276）%。 制備EL-4凋亡細胞的最佳條件為：310nm UV，照射距離10cm，照射時間60min，孵育時間16h。此條件誘導的凋亡細胞，應(yīng)用流式細胞計數(shù)法得出早期凋亡率（27.975±0.728）%，晚期凋亡率/壞死率（46.727±5.987）%。 細胞壞死的誘導方法均為：56℃加熱60min。應(yīng)用流式細胞計數(shù)法得出壞死

13、率（95.247±3.977）%（小鼠胸腺淋巴細胞）和（86.053±3.616）%（EL-4細胞）。 2.凋亡細胞能夠抑制LPS作用下的巨噬細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子的能力。和對照組相比，凋亡細胞下調(diào)巨噬細胞分泌炎性細胞因子的能力（P<0.05）。而且，凋亡細胞處理過的巨噬細胞再予以LPS刺激，培養(yǎng)物上清中炎癥性細胞因子TNF-α和IL-6分泌表達減少（P<0.05）。 3.壞死細胞能夠誘導巨噬細胞產(chǎn)生炎癥性因子。與對照組相

14、比較，與壞死細胞共培養(yǎng)后的巨噬細胞，產(chǎn)生炎癥性細胞因子的能力明顯增強（P<0.05）。而且，壞死細胞處理后的巨噬細胞再用LPS刺激，巨噬細胞產(chǎn)生炎癥性細胞因子如TNF-α和IL-6的量進一步增加，達到LPS單獨作用時的兩倍（P<0.05）。 結(jié)論： 1.Dex誘導小鼠胸腺細胞凋亡的最佳條件：在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液4ml，Dex濃度5×10-6M，細胞濃度5×106/ml，孵育時

15、間6h。UV誘導EL-4細胞凋亡的最佳條件：在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液4ml，310nm UV，照射距離10cm，照射時間60min，孵育時間16h。加熱法誘導兩種細胞壞死的最佳條件：56℃加熱60min。 2.在巨噬細胞的體外培養(yǎng)體系中，用凋亡細胞、LPS或兩者聯(lián)合應(yīng)用進行處理，檢測各組炎癥細胞因子產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，凋亡細胞能夠抑制巨噬細胞在LPS刺激下所產(chǎn)生炎癥性的細胞因子TNF-α

16、和IL-6。因此，凋亡細胞抑制免疫反應(yīng)，誘導免疫耐受可能與其巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子有關(guān)。 3.在巨噬細胞的體外培養(yǎng)體系中，分別用壞死細胞、LPS或兩者聯(lián)合應(yīng)用進行處理，檢測各組炎癥細胞因子產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，與未經(jīng)任何處理的對照組相比，壞死細胞和LPS均顯著提高了巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6的量。若壞死細胞與LPS聯(lián)合應(yīng)用，則兩種炎性細胞因子的分泌進一步增加。這一發(fā)現(xiàn)提示，細菌感染時所伴有的細胞壞死，會導致強烈而持久的炎性反應(yīng)