Intelectin在哮喘氣道上皮細胞炎性細胞因子表達中的作用和機制.pdf

1、研究背景:
　　目前哮喘發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢,但是哮喘的發(fā)病機制尚未完全闡明。哮喘是以氣道高反應性、粘液分泌增多和慢性嗜酸性粒細胞炎癥為特點。有些報道已證實主要在哮喘患者氣道上皮細胞和單核細胞中,一些趨化因子RANTES,MCP-3,MCP-4,eotaxin-1andeotaxin-2等的mRNA表達是增加的。趨化因子是8-10kDa的小分子細胞因子,根據(jù)每個蛋白分子一個或兩個半胱氨酸殘基在N末端的位置可以分為四類,即,CXC,C

2、C,C,和CXXXC。許多CC類趨化因子是由氣道上皮細胞產生的。IL13可以誘導上皮細胞CCL11(eotaxin),CCL24(eotaxin-2),andCCL26(eotaxin-3)的表達,且這些因子的表達在哮喘者是增加的。這些CC類趨化因子是嗜酸性粒細胞和嗜堿性細胞表面CCR受體的選擇性激動劑。
　　哮喘是以TH2細胞調節(jié)為主,分泌的細胞因子與IL4/5/9/13,雖然都與哮喘相關,但是IL13是現(xiàn)在認為最關鍵的因子。白

3、介素13是由TH2型細胞分泌的分子量為12kDa多效能分子,位于常染色體5q31上。白介素13是富含嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞炎癥、粘液上皮化生、組織纖維化和基底重塑強有力的刺激劑。白介素13能夠刺激哮喘相關的許多細胞,例如B淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、肺泡上皮細胞、成纖維細胞和氣道平滑肌細胞。一些實驗也證明,重組白介素13的應用或是肺中白介素13的過表達可以產生哮喘樣的氣道炎癥和氣道重塑。許多實驗證實白介素13在哮喘中是過

4、表達的,且與哮喘的特征TH2細胞炎癥和氣道重塑的發(fā)病機制相關。因此,我們用IL13刺激氣道上皮細胞,模擬哮喘樣作用。
　　人intelectin(ITLN)是一種分泌性的糖蛋白,由295個氨基酸和N端寡糖組成,它的基本結構單位是二硫鍵連接40kDa多肽成的120kDa的三聚體?？煞譃閕ntelectin-1和2。人intelectin也被稱作甘油磷酸肌醇連接的轉鐵蛋白受體、血管內皮細胞凝集素或網膜素。人ITLN基因位于染色體1q2

5、1.3上,含有8個外顯子,且人intelectin的mRNA表達于心臟、小腸、結腸和胸腺。屬于凝集素類,能夠識別特定的細菌壁組分,而不被其他凝集素所識別。所熟知的是它在小腸的潘氏細胞和分泌或是杯狀細胞表達。最近,也觀察到在氣道上皮細胞分泌細胞也有表達。可以識別存在于細菌、真菌和原蟲壁上右旋戊糖和呋喃半乳糖殘基,但在哺乳動物在不然,說明intelectin在抗原識別中起重要作用。Intelectin-1在小鼠小腸暴露于線旋毛蟲后,表達是上

6、調的,其同種型intelectin-2在小腸上皮細胞也被誘導。Intelectin-1是一個TH2細胞調節(jié)的抗菌蛋白,在哮喘患者支氣管上皮細胞中intelectin-1的基因表達水平是上調的,與IL13的表達上調相關。
　　第一部分，Intelectin-1在IL13誘導的氣道上皮細胞株A549和16HBE中炎性細胞因子表達中的作用
　　目的:探討intelectin-1基因在人肺泡/氣道上皮細胞分泌炎性因子中的作用。

7、>　　方法:實驗用兩種細胞系A549和16HBE。分為轉染高表達質粒分組為:(A)正常對照組(B)IL13組(C)轉染人ITLN1質粒組;轉染干擾質粒分組:(A)正常對照組+空質粒組(B)IL13+空質粒組(C)IL13+Itln1-shRNA質粒組。通過RealtimePCR方法檢測intelectin-1,CCL5和IL6mRNA的表達。ELISA方法檢測細胞上清液中相應因子的蛋白水平表達。地塞米松干預細胞:①對照組+DMSO②IL

8、13+DMSO③DEX100+IL13,然后通過RealtimePCR檢測細胞因子ITLN1,CCL5和IL6mRNA的表達。
　　結果:A549細胞中Intelectin-1,CCL5,IL6mRNA的表達水平,人ITLN1組和IL13組較對照組均明顯升高,p<0.05。而16HBE細胞Intelectin-1,CCL5,IL6mRNA的表達水平,人ITLN1組較對照組明顯增高,P<0.05均有統(tǒng)計學意義;IL13組較對照組In

9、telectin-1,IL6mRNA表達水平增高,P<0.05;但是IL13組較對照組CCL5mRNA表達水平有增高趨勢,但是未有統(tǒng)計意義。細胞A549和16HBE轉染人ITLN1-shRNA質粒后,A549和16HBE細胞系:IL13+人ITLN1shRNA質粒組較IL13組intelectin-1,CCL5和IL6的表達明顯下降,P<0.05,均有統(tǒng)計學意義。ELISA方法檢測蛋白水平:高表達實驗,人ITLN質粒組與對照組相比,IL

10、6,CCL5的蛋白表達水平明顯升高P<0.05。干擾實驗組:IL13組較對照組,CCL5和IL6的蛋白表達水平明顯升高P<0.05;IL13+ITLN1-shRNA組較IL13組,CCL5和IL6的蛋白表達水平明顯降低P<0.05。在A549細胞,地塞米松+IL13組較IL13組,ITLN1,CCL5和IL6明顯減少的,P<0.05;在16HBE細胞,地塞米松組較IL13組,ITLN1,CCL5和IL6均有顯著下降,并p<0.05,均有

11、統(tǒng)計學意義。
　　結論:轉入人ITLN1高表達質粒后,成功的促使細胞intelectin-1mRNA的高表達。一同檢測的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表達水平也相應的升高,可能與intelectin-1的表達升高有關。轉染人ITLN1干擾質粒后,抑制了intelectin-1mRNA的表達,一同檢測的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表達水平也相應的降低。Intelectin-1的表達可能抑制了CCL5和IL6的表達。糖皮

12、質激素可以抑制A549和16HBE細胞中ITLN1,CCL5和IL6的基因表達。由此得出,Intelectin-1在IL-13誘導的氣道上皮細胞中炎性細胞因子CCL5和IL-6的表達中有重要的作用。
　　第二部分，ERK信號通路在intelectin-1介導的氣道上皮細胞炎性細胞因子CCL5和IL6表達中的作用
　　目的:研究探討intelectin-1參與氣道上皮細胞中炎性細胞因子CCL5和IL-6表達的機制。
　　

13、方法:用IL-13和PD98059分別干預人肺上皮細胞株A549和16HBE細胞。PD98059實驗分組(1)對照組,(2)IL-13組,(3)IL-13+PD98059組。然后用RealTimePCR方法檢測細胞因子CCL5和IL6的mRNA的表達。轉染干擾質粒分組:(A)正常對照組+空質粒組(B)IL13+空質粒組(C)IL13+humanITLN1shRNA質粒組,通過RNA干擾的方法抑制IL-13誘導的intelectin-1表

14、達后,用Western-Blot檢測intelectin-1,ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平的變化。
　　結果:用PD98059干預IL13刺激的A549和16HBE細胞后,CCL5和IL6的mRNA表達水平,IL13+PD98059組較IL13組明顯降低,P<0.05。轉染humanITLN1shRNA質粒后,intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表達水平,IL-13組較對照組升高,P<0.05;IL-13+sh

15、RNA組中intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表達較IL-13組降低,P<0.05。
　　結論:ERK1/2的一種抑制劑PD98059,可以阻滯IL-13誘導的CCL5和IL6在A549和16HBE細胞中的表達。而且IL-13的刺激增加了ERK1/2磷酸化以及intelectin-1蛋白表達,但HumanITLLN1-shRNA質粒轉染抑制了IL-13誘導的intelectin-1蛋白表達及ERK1/2磷酸化。這些數(shù)據(jù)顯