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文檔簡(jiǎn)介
1、腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病(Chronic kidney diseases,CKD)進(jìn)展至終末期腎?。‥nd stage renal disease,ESRD)的共同病理改變,一旦進(jìn)入ESRD,患者將面臨昂貴的腎臟替代治療費(fèi)用,生活質(zhì)量的顯著降低和生存時(shí)間縮短等嚴(yán)峻問題。因此,找到新的抗纖維化治療方法至關(guān)重要。慢性缺氧不僅是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期的共同通路,更重要的是它是腎小管間質(zhì)損傷最重要的始動(dòng)因素。近期研究表明,小管上皮細(xì)胞
2、G2/M期阻滯,能夠通過(guò)激活成纖維細(xì)胞并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子(Transcriptional growth factor–β1,TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor,CTGF),Ⅳ型膠原α1(Collagen4A1,COL4A1)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的分泌,導(dǎo)致腎臟纖維化,那么,在缺氧微環(huán)境下,腎小管上皮細(xì)胞是否也發(fā)生細(xì)胞周
3、期阻滯進(jìn)而促進(jìn)纖維化呢?以及調(diào)控這一過(guò)程的具體分子機(jī)制是什么?都是亟待回答的問題。
MiRNAs(microRNAs,miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),它能夠通過(guò)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯或者促進(jìn)靶基因的降解調(diào)節(jié)基因表達(dá),與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系密切。近年來(lái),研究表明:缺氧能夠誘導(dǎo)大量miRNAs的表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)的功能。除此之外,一些研究也證明了有些 miRNAs參與細(xì)胞周期的調(diào)控。
4、我們前期通過(guò)基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-493在缺氧的HK2細(xì)胞中高表達(dá),進(jìn)一步在單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)模型及IgA腎?。↖gA nephropathy,IgAN)患者組織中也驗(yàn)證了miR-493呈高表達(dá)。進(jìn)一步,通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),STMN13'-非翻譯區(qū)(3'-Untranslated region,3'-UTR)存在miR-493的潛在結(jié)合位點(diǎn),而且它們的表達(dá)呈
5、負(fù)相關(guān)。STMN1是細(xì)胞周期的調(diào)控子,能夠編碼stathmin1蛋白,通過(guò)調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性在有絲分裂紡錘體形成中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,即STMN1能夠參與細(xì)胞周期的調(diào)控。由此我們推測(cè),缺氧微環(huán)境下,miR-493可能通過(guò)抑制 STMN1介導(dǎo)了腎小管細(xì)胞周期G2/M期阻滯進(jìn)而促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化,本研究將通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一推論。
目的:
1)研究慢性缺氧在腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的作用。
2
6、)研究miR-493在慢性缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的作用。
3)缺氧微環(huán)境下miR-493-STMN1通路在小管細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化中的調(diào)控作用。
4)體內(nèi)抑制miR-493的表達(dá),驗(yàn)證其逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的作用。
方法:
1)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot及免疫組化檢測(cè)缺氧微環(huán)境下細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
2)通過(guò)qRT-PCR
7、及原位雜交技術(shù)檢測(cè)缺氧微環(huán)境下miR-493的表達(dá),然后在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-493模擬物(mimic)及抑制物(inhibitor),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
3)通過(guò)熒光素報(bào)告基因、Western Blot及qRT-PCR驗(yàn)證miR-493對(duì)STMN1的調(diào)控作用及機(jī)制。然后,在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染STMN1-shRNA體外抑制STMN1的表達(dá),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及Weste
8、rn Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期改變及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)。
4)小鼠體內(nèi)注射miR-493 spongeAAV,通過(guò)qRT-PCR、免疫組化及Western Blot法驗(yàn)證下調(diào)miR-493后對(duì)腎間質(zhì)纖維化的逆轉(zhuǎn)作用。
結(jié)果:
1)慢性缺氧能夠介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞周期變化,發(fā)現(xiàn)G2/M期比例增加,進(jìn)一步通過(guò)Western Blot法檢
9、測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞及UUO模型發(fā)現(xiàn):G2/M期標(biāo)志(cyclinB1/cyclinD1)隨缺氧及梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增加,同時(shí)纖維化相關(guān)因子CTGF、COL4A1及α-SMA的表達(dá)增加。在UUO模型中,免疫組化結(jié)果顯示:G2/M期標(biāo)志(PH3/Ki67)在UUO14d后升高,并且Masson染色顯示腎間質(zhì)纖維化程度增加,表明缺氧微環(huán)境能夠介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
2)在缺氧微環(huán)境下miR-493高表達(dá),
10、并且能夠誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)缺氧處理的HK2細(xì)胞及IgAN患者組織中miR-493的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,miR-493高表達(dá),且原位雜交術(shù)也顯示miR-493在UUO14d后表達(dá)增加。然后,在HK2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-493mimic及inhibitor,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot發(fā)現(xiàn):miR-493mimic能夠增加小管細(xì)胞G2/M期比例且促進(jìn)纖維化
11、相關(guān)因子的表達(dá),相反,miR-493 inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)這一改變。
3)miR-493在轉(zhuǎn)錄后水平抑制STMN1的翻譯,介導(dǎo)小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯及腎間質(zhì)纖維化。
首先,生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)STMN1是miR-493的靶基因,進(jìn)一步通過(guò)熒光素報(bào)告基因驗(yàn)證了miR-493能夠直接調(diào)控STMN1。隨后,通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-493mimic檢測(cè)STMN1的mRNA及蛋白水平發(fā)現(xiàn):miR-493在轉(zhuǎn)錄后水平抑制STMN1
12、的翻譯調(diào)控STMN1的表達(dá)。最后,在UUO模型中檢測(cè)STMN1的表達(dá)發(fā)現(xiàn):隨梗阻時(shí)間增加表達(dá)降低;免疫組化及Masson結(jié)果顯示:UUO14d后,STMN1表達(dá)降低同時(shí)間質(zhì)纖維化程度增加。體外轉(zhuǎn)染STMN1 shRNA抑制STMN1的表達(dá)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染STMN1 shRNA后,G2/M期標(biāo)志(cyclinB1/cyclinD1)表達(dá)增加,同時(shí)纖維化相關(guān)因子CTGF,COL4A1及α-SMA的表達(dá)增加。
4)體內(nèi)干預(yù)m
13、iR-493的表達(dá)能夠抑制腎間質(zhì)纖維化。
在小鼠體內(nèi),通過(guò)注射miR-493 sponge腺相關(guān)病毒(Aeno-associated virus,AAV)抑制miR-493的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,miR-493 sponge AAV能夠降低纖維化相關(guān)分子α-SMA及COL4A1的表達(dá),增加STMN1的表達(dá),提示干預(yù)miR-493的表達(dá)能夠抑制腎間質(zhì)纖維化。
結(jié)論:綜上所述,我們研究表明miR-493在缺氧微環(huán)
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