Hedgehog信號(hào)通路介導(dǎo)血管周細(xì)胞參與腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎病隨病程進(jìn)展到最終階段的相同病理生理表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著患者健康。該病變表現(xiàn)腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞顯著增殖，細(xì)胞外膠原分泌增多，腎單位損傷及功能進(jìn)行性下降為特征。因此，為探索行之有效的防治措施，需徹底明確該病變機(jī)制。肌成纖維細(xì)胞的來源一直是本病變探討的焦點(diǎn)，相關(guān)文章表明，其來源或許涉及多種細(xì)胞。長期以來，腎小管上皮細(xì)胞-間葉細(xì)

2、胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）機(jī)制得到眾多學(xué)者首肯，但近來有學(xué)者提出不同觀點(diǎn)，認(rèn)為RIF與受Hh信號(hào)通路調(diào)節(jié)的周細(xì)胞的關(guān)系似乎更大。因此，本研究擬通過對(duì)Hh信號(hào)通路激活時(shí)周細(xì)胞各項(xiàng)特征變化的檢測來探索Hh信號(hào)通路是否參與了周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)分化，并且是否可以被Hh信號(hào)通路的相應(yīng)配體所干預(yù)。
　　材料與方法:
　　選用健康BALB/c乳鼠，雌雄不限，通過乳鼠腎細(xì)胞

3、原代培養(yǎng)，用免疫磁珠分選技術(shù)分離純化，并將所獲得的細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)NG2、SMA和CD31檢測，鑒定是否符合周細(xì)胞特征，經(jīng)三次傳代培養(yǎng)，收集周細(xì)胞。將已經(jīng)純化的周細(xì)胞分為對(duì)照組、SHH組和SHH+CPA組三組。對(duì)照組均于0h、24 h分別加終濃度為0.2％BSA的PBS; SHH組于0h、24 h分別加終濃度為1.5ng/mL SHH蛋白;SHH+CPA組在SHH組基礎(chǔ)上于每個(gè)SHH的添加時(shí)間點(diǎn)前2h加終濃度為0.25μ

4、m/mLCPA干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，均行免疫細(xì)胞化學(xué)SMA檢測、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測和Ⅰ型膠原ELISA檢測。
　　結(jié)果:
　　1.通過乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)，免疫磁珠分離純化，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，形態(tài)學(xué)符合周細(xì)胞特征:細(xì)胞寬大扁平，形狀不規(guī)則，并伴數(shù)個(gè)突起，胞核居中，單核或雙核;NG2和SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)，CD31免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性表達(dá)，證實(shí)為周細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞經(jīng)干預(yù)行上述檢測，免疫細(xì)胞

5、化學(xué)SMA檢測:對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)程度為121.3±13.7，SHH組為168±21.0，SHH+CPA組為132.1±19.8，即SHH組陽性表達(dá)程度高于對(duì)照組，SHH+CPA組陽性表達(dá)程度低于SHH組，差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測:對(duì)照組細(xì)胞遷徙距離24h、36h和48h分別為8.2000±1.4832μm、16.8000±1.0955μm、25.4000±1.1402μm，SHH組分別為15.600

6、0±2.0736μm、21.8000±1.9235μm、35.2000±0.8367μm， SHH+CPA組分別11.4000±1.9494μm、18.4000±1.5166μm、28.2000±0.4472μm，即相同時(shí)間點(diǎn)SHH組細(xì)胞遷徙距離多于對(duì)照組，SHH+CPA組細(xì)胞遷徙距離少于SHH組，差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測:對(duì)照組增殖活性為0.52±0.11，SHH組為0.67±0.12，SHH+C

7、PA組為0.55±0.09，SHH組細(xì)胞增殖活性高于對(duì)照組，SHH+CPA組細(xì)胞增殖活性低于SHH組，兩組差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ⅰ型膠原ELISA檢測:對(duì)照組為5.36±0.52，SHH組為9.22±0.68，SHH+CPA組為7.8±0.63，即SHH組細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原的量多于對(duì)照組，SHH+CPA組細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原的量少于SHH組，兩組差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.利用免