Rho激酶對休克血管反應性的調節(jié)作用及其機制.pdf

1、嚴重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管的低反應性，它表現(xiàn)為全身血管對縮血管物質和舒血管物質的反應降低或不反應，研究發(fā)現(xiàn)血管低反應性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、一氧化氮(nitricoxide，NO)水平增高、血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)鉀、鈣通道功能失常及細胞膜超極化有關，同時本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠失血性休克2h后，VSMC存在鈣失敏，鈣失敏在休克血管低反應性的發(fā)生中起重要作用。關于失血性休

2、克后VSMC鈣敏感性變化的調節(jié)機制，本實驗室前期研究證實與Rho激酶、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、蛋白激酶G(proteinkinaseG，PKG)有密切關系，但具體的調節(jié)機制及由哪一種分子起主要作用，目前尚不清楚。Rho激酶是小G蛋白Rho的下游蛋白，與VSMC鈣敏感性調節(jié)密切相關，同時研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶參與許多與VSMC鈣敏感性有關疾病的發(fā)生過程，如在高血壓、動脈硬化以及冠脈痙攣發(fā)生過程中具有重要的調節(jié)作用。

3、為探討Rho激酶對失血性休克血管反應的調控作用，Rho激酶是否通過調節(jié)失血性休克后鈣敏感性來調節(jié)血管反應性，以及Rho激酶調節(jié)失血性休克血管反應性和鈣敏感性的機制，本實驗采用大鼠失血性休克模型，分別從離體血管環(huán)水平，VSMC水平以及整體動物水平研究了Rho激酶在休克后血管反應性中的調節(jié)作用及其機制，具體內容包括三部分，分為：(1)Rho激酶在調節(jié)休克動物血管反應性和鈣敏感性中的作用；(2)Rho激酶調節(jié)休克動物血管反應性和鈣敏感性的機制

4、；(3)初步了解Rho激酶可否作為恢復失血性休克大鼠血管反應性的靶點。 主要實驗方法： 第一部分觀察了Rho激酶在調節(jié)失血性休克大鼠血管反應性和鈣敏感性中的作用，包括：離體血管環(huán)實驗，取失血性休克大鼠腸系膜上動脈(superiormesentericartery，SMA)，利用離體血管環(huán)測定技術，觀察休克后不同時相點(休克即刻，休克30min，休克1h，休克2h)SMA血管反應性(血管環(huán)對梯度濃度去甲腎上腺素(norep

5、inephrine，NE)的收縮反應性)和鈣敏感性(血管環(huán)在120mmol/LK+去極化狀態(tài)下，對梯度濃度Ca2+的反應性)，同時取腸系膜動脈測定休克后各時相點Rho激酶活性，分析血管反應性、鈣敏感性與Rho激酶活性之間的關系。觀察Rho激酶活性調節(jié)劑血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)，Insulin對血管反應性和鈣敏感性的影響；VSMC實驗，取腸系膜動脈，采用酶消化法獲取原代VSMC，觀察缺氧不同時間后(缺氧10m

6、in，30min，60min，90min，120min)VSMC對NE收縮反應的變化，同時觀察Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ和抑制劑Y-27632對VSMC收縮反應性的影響。 第二部分，研究Rho激酶調節(jié)休克動物血管反應性和鈣敏感的機制，包括：離體血管環(huán)實驗，取失血性休克2h大鼠SMA，觀察肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosinlightchainphosphatase，MLCP)抑制劑(CalyculinA)、肌球蛋白輕鏈激酶(myos

7、inlightchainkinase，MLCK)抑制劑(ML-9)對Rho激酶激動劑引起的失血性休克大鼠SMA鈣增敏作用的影響；VSMC實驗，觀察Rho激酶活性調節(jié)劑對缺氧VSMC的MLCP、MLCK活性以及肌球蛋白輕鏈(20kDamyosinlightchain，MLC20)磷酸化水平的影響，研究MLCP、MLCK和MLC20磷酸化在Rho激酶調節(jié)鈣敏感性中的作用。 第三部分，研究Rho激酶可否作為恢復血管反應性的調節(jié)靶點，采

8、用整體動物，觀察Rho激酶活性調節(jié)劑對失血性休克后大鼠平均動脈血壓(meanarterialpressure，MAP)、腸系膜上動脈血管管徑對NE收縮反應性的影響。 主要研究結果： 1.休克早期(休克即刻、休克30min)，SMA對NE的反應性和鈣敏感性明顯升高，最大收縮力(maximalcontraction，Emax)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；隨著休克時間的延長，血管環(huán)對NE反應性和鈣敏感性逐漸下降，在

9、休克晚期(休克1h和休克2h)，血管環(huán)對NE反應性和鈣敏感性明顯降低，Emax明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。與正常對照組相比，Rho激酶活性在休克即刻明顯升高(P＜0.05)，隨著休克時間延長，Rho激酶活性逐漸下降，在休克1及2h，Rho激酶活性明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。SMA對NE反應性與Rho激酶活性變化之間呈直線正相關，相關系數(shù)r=0.9861(P＜0.05)；SMA對鈣的敏感性與Rho激酶活性變化之間呈

10、直線正相關，相關系數(shù)r=0.9704(P＜0.05)。Rho激酶活性抑制劑Insulin(10-7mol/L)可明顯降低休克即刻SMA血管環(huán)對NE的反應性和鈣敏感性(P＜0.05或P＜0.01)。Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可明顯升高休克2h血管環(huán)對NE反應性和鈣敏感性(P＜0.05或P＜0.01)，Emax明顯升高(P＜0.01)，而Rho激酶特異性抑制劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的

11、休克2h血管環(huán)對NE反應性和鈣敏感性的增高。 2.VSMC在缺氧10min時對NE收縮反應性與正常對照組相比有所升高，隨著缺氧時間的延長，VSMC對NE的收縮反應逐漸下降，在缺氧60min、90min和120min時，VSMC對NE的收縮反應性顯著低于正常對照組(P＜0.05或P＜0.01)。Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可明顯升高缺氧90minVSMC對NE的收縮反應性(P＜0.05)，而Rho激酶特異性抑制

12、劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的缺氧VSMC收縮反應性的升高。 3.MLCP抑制劑CalyculinA(10-7mol/L)可進一步增加由Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的失血性休克SMA血管環(huán)鈣敏感性的升高，Emax明顯升高(P＜0.05)，而MLCK抑制劑ML-9(10-7mol/L)對Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的SMA血管環(huán)鈣增敏無明顯的調節(jié)作用(

13、P＞0.05)。 4.VSMC缺氧90min后MLCP活性明顯升高，Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可降低缺氧引起的VSMCMLCP活性的升高(P＜0.01)，Rho激酶特異性抑制劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的缺氧VSMCMLCP活性的降低。 5.VSMC缺氧90min后MLCK活性明顯降低，Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)和抑制劑Y-

14、27632(10-5mol/L)對缺氧后VSMCMLCK活性無明顯調節(jié)作用。 6.MLC20磷酸化表達水平在VSMC缺氧90min后明顯降低(P＜0.01)，Rho激酶激動劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可升高缺氧后VSMCMLC20磷酸化表達水平，Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的MLC20磷酸化水平的升高。 7.失血性休克后大鼠對NE的升壓反應和腸系膜上動脈對NE的收縮反應明顯降低(P＜0

15、.05或P＜0.01)，Rho激酶激動劑精氨酸血管加壓素(argininevasopressin,AVP)(0.4U/kg)可增加失血性休克大鼠對NE的升壓反應和腸系膜上動脈對NE的收縮反應(P＜0.05或P＜0.01)，Y-27632(3μg/100g)可拮抗由AVP引起NE的升壓反應和腸系膜上動脈對NE收縮反應的升高。 結論： 1.失血性休克后大鼠血管反應性和鈣敏感性呈雙相變化，Rho激酶可通過調節(jié)血管平滑肌的鈣敏感

16、性來調節(jié)血管的反應性，Rho激酶在失血性休克大鼠血管反應性的雙相變化中具有重要的調節(jié)作用。 2.Rho激酶可通過調節(jié)MLCP的活性和MLC20磷酸化水平來調節(jié)失血性休克動物血管的反應性。休克早期，由于Rho激酶活性升高，MLCP活性降低，MLC20磷酸化水平升高，血管反應性升高；在休克晚期，Rho激酶活性降低，MLCP活性升高，MLC20磷酸化水平降低，血管反應性降低。MLCK在Rho激酶調節(jié)VSMC鈣敏感性變化中無明顯作用。