注射用核糖核酸Ⅱ調(diào)控人白血病細(xì)胞增殖凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、白血病是一類以不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱及肝臟、脾臟、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛為臨床表現(xiàn)的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病[1]。白血病的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，與染色體斷裂、易位所引起的癌基因激活、抑癌基因失活等多種因素有關(guān)[2]。盡管目前臨床所采用的骨髓移植、化療等方法在白血病的治療方面取得了極大的進(jìn)展，但因其治療價(jià)格昂貴、配型困難、副作用多等不利因素削弱了這些治療措施對(duì)白血病的治療效果，迫切需要尋找價(jià)格低廉而療效明顯的藥物。
　　注射用核

2、糖核酸Ⅱ（Ribonucleic acidⅡ）是免疫核糖核酸的成員之一，具有提高細(xì)胞免疫功能和抗腫瘤等作用[3]，對(duì)肺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤藥物活性[4]，這一作用主要是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷來實(shí)現(xiàn)的。而注射用核糖核酸Ⅱ?qū)τ诎籽〉闹委熜Ч皺C(jī)制研究極少見報(bào)道。
　　磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphoinositide3-kinases，PI3K）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可磷酸化細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員[5

3、]。AKT（Protein kinase B，AKT）是一種受磷酸肌醇募集到達(dá)質(zhì)膜后激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中扮演極其重要角色[6]。PI3K/AKT信號(hào)通路可通過激活p53等下游基因影響細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖和凋亡，在調(diào)控細(xì)胞凋亡增殖過程中發(fā)揮重要作用[7]。p53還可在DNA受損后通過維持基因組穩(wěn)定參與DNA的修復(fù)過程來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖凋亡[8]。因此，PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的影響是多種抗腫瘤藥物發(fā)

4、揮其作用的重要環(huán)節(jié)。
　　活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的重要分子，參與了體內(nèi)多種病理生理過程；其中，內(nèi)源性的ROS對(duì)細(xì)胞的凋亡起著重要的作用[9]。研究表明，ROS介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路及其下游信號(hào)分子表達(dá)水平的改變?cè)诙喾N腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中與AKT的活化密切相關(guān)[10]。胞內(nèi)ROS水平改變引起很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA片段化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

5、　　因此，探討注射用核糖核酸Ⅱ是否具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用，這一抗腫瘤作用是否與PI3K/AKT信號(hào)通路和ROS有關(guān)，以及二者的關(guān)系可否為注射用核糖核酸Ⅱ的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：
　　本研究以人慢性髓系白血病K562細(xì)胞和急性髓系白血病KG1a細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察注射用核糖核酸Ⅱ?qū)?xì)胞凋亡和周期的影響，研究該藥物對(duì)K562和KG1a細(xì)胞中ROS水平和PI3K/AKT信號(hào)通路分子表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)

6、白血病細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞系K562和KG1a細(xì)胞，分別加入注射用核糖核酸Ⅱ以100～300 mg·L-1連續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h，CCK-8法（Cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細(xì)胞增殖的影響；100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometr

7、y，F(xiàn)CM）檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細(xì)胞凋亡和周期的影響及；Hochest染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、p53的表達(dá)及其下游周期相關(guān)蛋白p21、Cyclin D1、CDK4的表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)；WB檢測(cè)150 mg·L-1注射用核糖

8、核酸Ⅱ誘導(dǎo)K562和KG1a細(xì)胞24 h后，F(xiàn)CM檢測(cè)白血病細(xì)胞中ROS水平改變以及加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)后p-PI3K、p-AKT和p53蛋白的表達(dá)變化，探討注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中ROS對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路影響。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8法結(jié)果顯示：注射用核糖核酸Ⅱ濃度分別采用100、150、200 mg·L-1作用K562和KG1a細(xì)胞12、2

9、4和48 h后，K562和KG1a細(xì)胞的增殖受到顯著抑制（P＜0.05），且呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　2.FCM法檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯：K562細(xì)胞G0/G1期的周期比例由對(duì)照組的22.91%分別增加至28.35%、37.43%、42.40%；KG1a細(xì)胞由對(duì)照組的23.57%分別增加至28.74%、38.45%、49.77%；細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期呈濃度依賴（P＜0.05），而G2/M期、S期比例則逐漸減少。
　　3.FC

10、M檢測(cè)細(xì)胞凋亡：100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)K562和KG1a細(xì)胞24 h后,其中K562細(xì)胞的凋亡率由空白組4.75%分別增加至為9.21%、15.8%、29.36%；KG1a細(xì)胞的凋亡率由空白組6.91%分別增加至為10.06%、56.49%、77.24%；且細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性（P＜0.05）。
　　4.Hoechst染色結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的加大，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂

11、、核邊集及染色加深發(fā)出藍(lán)白色熒光，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變。
　　5.WB結(jié)果顯示：注射用核糖核酸Ⅱ可以明顯上調(diào)p53、p21、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)；下調(diào)p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、Bcl-2和Cyclin D1的表達(dá)。
　　6.FCM法檢測(cè)ROS結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增加，K562和KG1a細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平均逐漸增高，呈藥物濃度依賴性（P＜0.05）。
　　7.NAC

12、誘導(dǎo)后WB結(jié)果顯示：經(jīng)NAC預(yù)處理后再使用注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)白血病細(xì)胞，較只用注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白水平顯著升高了磷酸化PI3K/AKT的表達(dá)和降低了p53的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.注射用核糖核酸Ⅱ具有抑制人急、慢性白血病KG1a和K562細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　2．注射用核糖核酸Ⅱ可通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，激活p53，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4，阻滯細(xì)胞