異牛肝菌素對(duì)人慢性髓系白血病K562細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：隨著社會(huì)的發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到化學(xué)合成類藥品給人類自身健康及生活環(huán)境帶來的負(fù)面影響，回歸自然、保護(hù)環(huán)境已成為一種處理人類和環(huán)境關(guān)系的潮流思想。天然藥物以其在治療上的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（來自大自然，毒副作用小及治病范圍廣）而倍受重視。然而大多數(shù)天然藥物的成分不明，炮制方法單一。其有效成分的分離純化技術(shù)低下，治病機(jī)制大多不為人知，因此限制了其應(yīng)用范圍。為了更好的利用天然藥物，對(duì)其有效成分進(jìn)行分離純化并研究其作用機(jī)制迫在眉睫。
　　近年來，

2、大量研究發(fā)現(xiàn)真菌和植物的次生代謝產(chǎn)物在抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等方面有顯著的作用。2014年本課題組從一種食藥兼用的大型真菌—黃乳粘蓋牛肝菌的石油醚相中純化出一種代謝產(chǎn)物，化學(xué)名稱為：3,6-二羥基-2-(2Z,6E,10E)-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯，和之前研究發(fā)現(xiàn)的牛肝菌素是同分異構(gòu)體，命名為異牛肝菌素（iso-suillin），經(jīng)過幾年的研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，

3、能夠有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等腫瘤細(xì)胞系的生長，而且與順鉑（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）比較，iso-suillin表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑瘤作用，并且對(duì)正常人的淋巴細(xì)胞沒有明顯毒性。
　　白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細(xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時(shí)抑制正常造血功能。我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中

4、占第六位，嚴(yán)重威脅人類健康。雖然多種療法對(duì)白血病的治療有一定療效，但白血病仍然是一種死亡率很高的疾病，尋找治療白血病的藥物仍然是目前研究者的迫切任務(wù)。本課題組對(duì)人白血病K562細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，但其對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制沒有深入了解，本研究在之前研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)iso-suillin抑制K562細(xì)胞增殖的分子機(jī)制進(jìn)行深入探索。通

5、過揭示iso-suillin誘導(dǎo)K562細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制，尋找對(duì)白血病細(xì)胞殺傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為白血病的治療提供理論基礎(chǔ)及可能的藥物。
　　方法：
　　1.K562細(xì)胞培養(yǎng)
　　K562細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基，含10％FBS、1%青鏈霉素混合液(100×)，置于37℃5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.基因芯片技術(shù)檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學(xué)分析
　　常規(guī)

6、培養(yǎng)K562細(xì)胞，用終濃度為5.48μM的iso-suillin作用24 h，提取總RNA后進(jìn)行RNA品質(zhì)檢測(cè)，RNA信號(hào)放大與熒光標(biāo)定后，Phalanx OneArrayTM雜交，影像掃描與數(shù)據(jù)擷取，對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和校正，計(jì)算對(duì)照組（C）和加藥組（T）熒光訊號(hào)的比值，根據(jù)log2（ratio）和p-value篩選差異表達(dá)基因，差異基因的篩選條件設(shè)定為log2|ratio|≥1且p-value<0.05；篩選出對(duì)照組和iso-sui

7、llin處理組差異表達(dá)基因后，差異基因分別進(jìn)行GO term功能富集分析（包括所處的細(xì)胞組分CC、分子功能MF和參與的生物過程BP）和KEGG信號(hào)通路富集分析。根據(jù)挑選出的差異基因，計(jì)算這些差異基因同GO分類中某或幾個(gè)特定的分支的超幾何分布關(guān)系，GO分析會(huì)對(duì)每個(gè)有差異基因存在的GO返回一個(gè)P值，小的P值表示差異基因在該GO中出現(xiàn)了富集；根據(jù)挑選出的差異基因，計(jì)算這些差異基因同KEGG pathway的超幾何分布關(guān)系，pathway分析會(huì)

8、對(duì)每個(gè)有差異基因存在的pathway返回一個(gè)P值，小的P值表示差異基因在該pathway中出現(xiàn)了富集。P值越小，-lin（P-value）越大，富集顯著性越明顯。用-lin（P-value）作餅形圖。
　　3.MTT法檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞抑制率
　　不同濃度iso-suillin處理K562細(xì)胞后，加入5 mg/ml MTT2-4 h，用DMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)吸光值，計(jì)算抑制率并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

9、
　　4.軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞克隆形成的影響
　　把處于對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×105/ml濃度種于6孔板，用不同終濃度iso-suillin處理K562細(xì)胞，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以每瓶800個(gè)細(xì)胞種于12.5 cm2小培養(yǎng)瓶中，待有明顯肉眼可見的克隆形成時(shí)倒掉培養(yǎng)基，每瓶加入1 ml軟瓊脂，置冰上冷卻凝固，用結(jié)晶紫染色5 min，用預(yù)冷PBS緩沖液洗2次，拍照

10、，克隆形成計(jì)數(shù)并測(cè)量克隆直徑。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響
　　把處于對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×105/ml濃度種于6孔板，加入不同濃度iso-suillin，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。離心棄上清，用預(yù)冷PBS緩沖液洗2次，用70%乙醇固定過夜（先用300μlPBS重懸細(xì)胞，再緩慢滴加700μl無水乙醇，混勻），離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，每個(gè)細(xì)

11、胞樣品加入500μl PI染色工作液（50 ug/ml，含RNA酶），37℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，flowjo7.6.5軟件分析各時(shí)期細(xì)胞分布，計(jì)算處于G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞數(shù)目，作直方圖。
　　6.Western blot檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　K562總蛋白提取后，用12%分離膠和4%濃縮膠電泳，0.22μM PVDF膜200 mA恒流濕轉(zhuǎn)1-2 h

12、，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜3次，孵育二抗37℃1 h，洗膜3次，掃膜，測(cè)量條帶灰度值。
　　7.K562細(xì)胞p53基因突變驗(yàn)證
　　常規(guī)方法提取K562總DNA，用引物F-P53 CATCGCTATCTGAGCAG CGCTCA和R-P53 TCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGAC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品用1%瓊脂糖凝膠100 V20 min電泳，紫外線下找到對(duì)應(yīng)條帶，切膠回收，得到p53基因片

13、段，送武漢擎科測(cè)序部做雙向測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站查取p53mRNA CDS序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。
　　8.P38抑制劑對(duì)iso-suillin抑制K562細(xì)胞增殖相關(guān)因素的影響
　　培養(yǎng)的K562細(xì)胞中加入p38抑制劑（SB203580）0.5μM（IC50）預(yù)處理30 min后，再用iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h，按照上述方法進(jìn)行MTT檢測(cè)K562細(xì)胞增殖抑制率，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成情

14、況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；iso-suillin處理K562細(xì)胞3 h，western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，用SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)均數(shù)作單因素方差分析（One-Way ANOVA），取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學(xué)分析與對(duì)照組（C）相比，用藥組（T）差異表達(dá)的基

15、因有639個(gè)，其中上調(diào)443個(gè)，下調(diào)196個(gè)。上調(diào)的主要基因有ATF3、GFPT1、S100P、PHGDH、ATP2A3、NRCAM、SESN2、ATF5、LAMP3和LAD1，有多個(gè)基因與促凋亡因子相關(guān)，如多種腫瘤壞死因子基因（TNFAIP3、TNFRSF9、TNFRSF10B、TNFRSF11B）、DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白基因DDIT4和分化因子GDF15；下調(diào)的基因主要有MFAP3、LTNFRSF10B、SH3BP2、RUNDC3B

16、、DIP2C、SLC7A11、WARS、AAK1、ENAH、LPGAT1和EPAS1，且促有絲分裂信號(hào)成分RAS相關(guān)基因（REM1、RAB15）表達(dá)明顯降低，可能與iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用有關(guān)。進(jìn)一步的篩選我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期激酶抑制蛋白家族成員CDKN1A（p21）的表達(dá)明顯上升。
　　Go term功能分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因的產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、運(yùn)輸小泡、溶酶體；差異基因的分子功能主要與維

17、生素（輔酶）、酶的結(jié)合相關(guān)，同時(shí)與中性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；差異基因的生物功能主要涉及到細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性死亡和絲氨酸家族氨基酸代謝過程。
　　差異基因的KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，有多條信號(hào)通路與差異表達(dá)的基因相關(guān)，根據(jù)差異表達(dá)基因，我們分別列出了最可能（P值最小）的7條差異基因的KEGG通路：甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、p53信號(hào)通路、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、葉酸的一碳庫、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、氮素代謝和氨酰tRNA生物

18、合成。P值分別為0.0004、0.0055、0.0105、0.0131、0.016、0.0352和0.0403。-lin（P-value）分別為1.31、0.49、0.41、0.43、0.44、0.25、0.25。差異基因主要在物質(zhì)代謝相關(guān)的信號(hào)通途和p53信號(hào)通路顯著富集。
　　2.MTT檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞抑制率
　　K562細(xì)胞經(jīng)1.37、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處

19、理24 h后，抑制率分別為0.28±4.21、0.16±2.59、11.23±8.33、29.32±2.35（%），組間差異顯著。結(jié)果表明：iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞有明顯抑制，且有濃度依賴性。
　　3.軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562增殖活性的影響
　　0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h后，克隆形成率依次為39.08±13.13、25.8±

20、11.91、15.75±5.25、11.67±8.80（%）組間差異顯著；克隆大小依次為1.88±0.17、1.88±0.30、1.15±0.07、0.77±0.30（mm）。結(jié)果表明：隨iso-suillin濃度增加，克隆形成率明顯降低且克隆的面積變小。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響
　　K562細(xì)胞在0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理24 h后，

21、G1期細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為48.31±2.52％、60.27±3.67％、61.07±3.59％和67.70±2.19％；S期細(xì)胞分別為34.48±1.57％、17.98±3.09％、21.33±5.89％和18.18±7.58％；G2期細(xì)胞分別為17.22±1.76％、21.74±0.59％、17.60±2.60％和14.12±5.56％。隨著藥物濃度的增加G1期細(xì)胞所占比例明顯增加（P<0.02）；S和G2所占比例下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

22、。
　　5.Western blot檢測(cè)iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　用0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h，提取總蛋白，用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化情況，結(jié)果如下：與內(nèi)參蛋白β-actin比較， cyclinD相對(duì)含量為0.8072±0.0134、0.8098±0.0431、0.7388±0.0594、0.6

23、954±0.0296； CDK4分別為0.0216±0.0003、0.0202±0.0009、0.0095±0.0006、0.0038±0.0004；PCNA為0.1256±0.0027、0.0573±0.0016、0.0505±0.0026、0.0468±0.0013；p-RB1.4254±0.0358、0.7835±0.0485、0.8632±0.0399、0.2117±0.0276；E2F-10.4987±0.0423、0.275

24、4±0.0099、0.2568±0.0119、0.0419±0.0005；p210.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019；p380.76410.0149、0.8479±0.0251、0.7765±0.0198、0.8378±0.0667；p38（phospho Thr180/Tyr182）0.1859±0.0025、0.1144±0.0052、0.0982±0.006

25、1、0.0911±0.0113，隨iso-suillin濃度的增加K562細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白cyclinD、CDK4、PCNA和E2F-1的相對(duì)含量逐漸減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制蛋白p21的相對(duì)含量明顯升高，但p38的磷酸化程度在iso-suillin作用于K562細(xì)胞24 h明顯降低（P<0.05）。
　　用5.48μM iso-suillin作用于K562細(xì)胞0、3、6、12、24 h，提

26、取總蛋白， western測(cè)得p-p38相對(duì)含量為0.0050±0.0003、0.0411±0.0020、0.0133±0.0005、0.0036±0.0013、0.0103±0.0006；γ-H2AX的相對(duì)含量分別為0.0295±0.0032、0.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019。結(jié)果顯示iso-suillin作用于K562細(xì)胞后，p38的磷酸化程度先升后降在3

27、 h時(shí)最高，γ-H2AX的相對(duì)含量逐漸升高在6 h后顯著升高。
　　6.K562細(xì)胞p53基因突變驗(yàn)證
　　K562細(xì)胞中p53基因發(fā)生移碼突變，在p53蛋白編碼區(qū)序列（CDS）的406和407位點(diǎn)插入了一個(gè)鳥嘌呤核糖核苷酸，導(dǎo)至CDS序列的442-444位點(diǎn)提前出現(xiàn)終止密碼子TAG；用western bot無法檢測(cè)到正常p53蛋白表達(dá)，如果p53突變體被表達(dá)，其分子量大約15 Kda，但該突變體蛋白未被檢測(cè)到。
　　

28、7.P38抑制劑處理后iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞抑制率、克隆形成率及細(xì)胞周期分布的影響
　　對(duì)照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細(xì)胞的增殖抑制率分別為0、6.02±3.63、20.35±3.78、36.33±15.76(%)；克隆形成率為36.83±4.09、17.33±11.7、7.58±2.48、2.71±1.87(%)。與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞增殖

29、都受到了不同程度的抑制作用，但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細(xì)胞相比，SB203580+iso-suillin細(xì)胞增殖抑制作用明顯減弱，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得對(duì)照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細(xì)胞的周期分布情況：G0/G1所占比例分別為39.26±1.17、43.53±0.97、44.00±1.24、65

30、.22±4.74(%)；S期32.26±2.60、25.14±2.82、26.43±4.21、18.95±3.47(%)；G2期28.47、1.43±31.33、1.86、29.58±2.98、15.83±1.28(%)。與對(duì)照組相比，處理組 G0/G1期細(xì)胞比例都有所增加，但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細(xì)胞相比，SB203580+iso-suillin組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)

31、意義（P<0.05）。
　　8.P38抑制劑處理后iso-suillin對(duì)K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　Iso-suillin加藥3 h后，對(duì)照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組 K562細(xì)胞中相應(yīng)蛋白表達(dá)量為：p21相對(duì)含量為0.4984±0.0087、0.3296±0.0603、0.2091±0.0183、1.1401±0.023；p-p38蛋白的相對(duì)含

32、量分別為0.3300±0.0052、0.1298±0.0163、0.1298±0.0164、0.1205±0.0054、0.6562±0.0312。發(fā)現(xiàn)加入p38抑制劑SB203580后p38磷酸化程度和p21相對(duì)含量明顯降低；加SB203580后，SB203580+iso-suillin處理組細(xì)胞p38磷酸化程度和p21含量相對(duì)iso-suillin處理組明顯降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Is