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文檔簡介
1、目的:隨著社會(huì)的發(fā)展,人們逐漸意識到化學(xué)合成類藥品給人類自身健康及生活環(huán)境帶來的負(fù)面影響,回歸自然、保護(hù)環(huán)境已成為一種處理人類和環(huán)境關(guān)系的潮流思想。天然藥物以其在治療上的獨(dú)特優(yōu)勢(來自大自然,毒副作用小及治病范圍廣)而倍受重視。然而大多數(shù)天然藥物的成分不明,炮制方法單一。其有效成分的分離純化技術(shù)低下,治病機(jī)制大多不為人知,因此限制了其應(yīng)用范圍。為了更好的利用天然藥物,對其有效成分進(jìn)行分離純化并研究其作用機(jī)制迫在眉睫。
近年來,
2、大量研究發(fā)現(xiàn)真菌和植物的次生代謝產(chǎn)物在抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等方面有顯著的作用。2014年本課題組從一種食藥兼用的大型真菌—黃乳粘蓋牛肝菌的石油醚相中純化出一種代謝產(chǎn)物,化學(xué)名稱為:3,6-二羥基-2-(2Z,6E,10E)-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯,和之前研究發(fā)現(xiàn)的牛肝菌素是同分異構(gòu)體,命名為異牛肝菌素(iso-suillin),經(jīng)過幾年的研究發(fā)現(xiàn),iso-suillin表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性,
3、能夠有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等腫瘤細(xì)胞系的生長,而且與順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)比較,iso-suillin表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑瘤作用,并且對正常人的淋巴細(xì)胞沒有明顯毒性。
白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病??寺⌒园籽〖?xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э亍⒎只系K、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積,并浸潤其他非造血組織和器官,同時(shí)抑制正常造血功能。我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中
4、占第六位,嚴(yán)重威脅人類健康。雖然多種療法對白血病的治療有一定療效,但白血病仍然是一種死亡率很高的疾病,尋找治療白血病的藥物仍然是目前研究者的迫切任務(wù)。本課題組對人白血病K562細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),iso-suillin對K562細(xì)胞的抑制作用可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn),但其對K562細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制沒有深入了解,本研究在之前研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)對iso-suillin抑制K562細(xì)胞增殖的分子機(jī)制進(jìn)行深入探索。通
5、過揭示iso-suillin誘導(dǎo)K562細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制,尋找對白血病細(xì)胞殺傷的關(guān)鍵靶點(diǎn),為白血病的治療提供理論基礎(chǔ)及可能的藥物。
方法:
1.K562細(xì)胞培養(yǎng)
K562細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基,含10%FBS、1%青鏈霉素混合液(100×),置于37℃5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.基因芯片技術(shù)檢測iso-suillin對K562細(xì)胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學(xué)分析
常規(guī)
6、培養(yǎng)K562細(xì)胞,用終濃度為5.48μM的iso-suillin作用24 h,提取總RNA后進(jìn)行RNA品質(zhì)檢測,RNA信號放大與熒光標(biāo)定后,Phalanx OneArrayTM雜交,影像掃描與數(shù)據(jù)擷取,對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和校正,計(jì)算對照組(C)和加藥組(T)熒光訊號的比值,根據(jù)log2(ratio)和p-value篩選差異表達(dá)基因,差異基因的篩選條件設(shè)定為log2|ratio|≥1且p-value<0.05;篩選出對照組和iso-sui
7、llin處理組差異表達(dá)基因后,差異基因分別進(jìn)行GO term功能富集分析(包括所處的細(xì)胞組分CC、分子功能MF和參與的生物過程BP)和KEGG信號通路富集分析。根據(jù)挑選出的差異基因,計(jì)算這些差異基因同GO分類中某或幾個(gè)特定的分支的超幾何分布關(guān)系,GO分析會(huì)對每個(gè)有差異基因存在的GO返回一個(gè)P值,小的P值表示差異基因在該GO中出現(xiàn)了富集;根據(jù)挑選出的差異基因,計(jì)算這些差異基因同KEGG pathway的超幾何分布關(guān)系,pathway分析會(huì)
8、對每個(gè)有差異基因存在的pathway返回一個(gè)P值,小的P值表示差異基因在該pathway中出現(xiàn)了富集。P值越小,-lin(P-value)越大,富集顯著性越明顯。用-lin(P-value)作餅形圖。
3.MTT法檢測iso-suillin對K562細(xì)胞抑制率
不同濃度iso-suillin處理K562細(xì)胞后,加入5 mg/ml MTT2-4 h,用DMSO溶解結(jié)晶,酶標(biāo)儀測吸光值,計(jì)算抑制率并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。
9、
4.軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測iso-suillin對K562細(xì)胞克隆形成的影響
把處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×105/ml濃度種于6孔板,用不同終濃度iso-suillin處理K562細(xì)胞,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,以每瓶800個(gè)細(xì)胞種于12.5 cm2小培養(yǎng)瓶中,待有明顯肉眼可見的克隆形成時(shí)倒掉培養(yǎng)基,每瓶加入1 ml軟瓊脂,置冰上冷卻凝固,用結(jié)晶紫染色5 min,用預(yù)冷PBS緩沖液洗2次,拍照
10、,克隆形成計(jì)數(shù)并測量克隆直徑。
5.流式細(xì)胞術(shù)檢測iso-suillin對K562細(xì)胞周期分布的影響
把處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×105/ml濃度種于6孔板,加入不同濃度iso-suillin,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。離心棄上清,用預(yù)冷PBS緩沖液洗2次,用70%乙醇固定過夜(先用300μlPBS重懸細(xì)胞,再緩慢滴加700μl無水乙醇,混勻),離心收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗2次,每個(gè)細(xì)
11、胞樣品加入500μl PI染色工作液(50 ug/ml,含RNA酶),37℃避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測,flowjo7.6.5軟件分析各時(shí)期細(xì)胞分布,計(jì)算處于G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞數(shù)目,作直方圖。
6.Western blot檢測iso-suillin對K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
K562總蛋白提取后,用12%分離膠和4%濃縮膠電泳,0.22μM PVDF膜200 mA恒流濕轉(zhuǎn)1-2 h
12、,5%脫脂奶粉封閉2.5 h,4℃孵育一抗過夜,洗膜3次,孵育二抗37℃1 h,洗膜3次,掃膜,測量條帶灰度值。
7.K562細(xì)胞p53基因突變驗(yàn)證
常規(guī)方法提取K562總DNA,用引物F-P53 CATCGCTATCTGAGCAG CGCTCA和R-P53 TCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGAC進(jìn)行PCR擴(kuò)增,樣品用1%瓊脂糖凝膠100 V20 min電泳,紫外線下找到對應(yīng)條帶,切膠回收,得到p53基因片
13、段,送武漢擎科測序部做雙向測序,在NCBI網(wǎng)站查取p53mRNA CDS序列,用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對。
8.P38抑制劑對iso-suillin抑制K562細(xì)胞增殖相關(guān)因素的影響
培養(yǎng)的K562細(xì)胞中加入p38抑制劑(SB203580)0.5μM(IC50)預(yù)處理30 min后,再用iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h,按照上述方法進(jìn)行MTT檢測K562細(xì)胞增殖抑制率,克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成情
14、況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布;iso-suillin處理K562細(xì)胞3 h,western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示,用SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件對均數(shù)作單因素方差分析(One-Way ANOVA),取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.Iso-suillin對K562細(xì)胞全基因體轉(zhuǎn)錄譜的影響及生物信息學(xué)分析與對照組(C)相比,用藥組(T)差異表達(dá)的基
15、因有639個(gè),其中上調(diào)443個(gè),下調(diào)196個(gè)。上調(diào)的主要基因有ATF3、GFPT1、S100P、PHGDH、ATP2A3、NRCAM、SESN2、ATF5、LAMP3和LAD1,有多個(gè)基因與促凋亡因子相關(guān),如多種腫瘤壞死因子基因(TNFAIP3、TNFRSF9、TNFRSF10B、TNFRSF11B)、DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白基因DDIT4和分化因子GDF15;下調(diào)的基因主要有MFAP3、LTNFRSF10B、SH3BP2、RUNDC3B
16、、DIP2C、SLC7A11、WARS、AAK1、ENAH、LPGAT1和EPAS1,且促有絲分裂信號成分RAS相關(guān)基因(REM1、RAB15)表達(dá)明顯降低,可能與iso-suillin對K562細(xì)胞的增殖抑制作用有關(guān)。進(jìn)一步的篩選我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期激酶抑制蛋白家族成員CDKN1A(p21)的表達(dá)明顯上升。
Go term功能分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因的產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、運(yùn)輸小泡、溶酶體;差異基因的分子功能主要與維
17、生素(輔酶)、酶的結(jié)合相關(guān),同時(shí)與中性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);差異基因的生物功能主要涉及到細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性死亡和絲氨酸家族氨基酸代謝過程。
差異基因的KEGG信號通路分析結(jié)果顯示,有多條信號通路與差異表達(dá)的基因相關(guān),根據(jù)差異表達(dá)基因,我們分別列出了最可能(P值最?。┑?條差異基因的KEGG通路:甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、p53信號通路、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、葉酸的一碳庫、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、氮素代謝和氨酰tRNA生物
18、合成。P值分別為0.0004、0.0055、0.0105、0.0131、0.016、0.0352和0.0403。-lin(P-value)分別為1.31、0.49、0.41、0.43、0.44、0.25、0.25。差異基因主要在物質(zhì)代謝相關(guān)的信號通途和p53信號通路顯著富集。
2.MTT檢測iso-suillin對K562細(xì)胞抑制率
K562細(xì)胞經(jīng)1.37、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處
19、理24 h后,抑制率分別為0.28±4.21、0.16±2.59、11.23±8.33、29.32±2.35(%),組間差異顯著。結(jié)果表明:iso-suillin對K562細(xì)胞有明顯抑制,且有濃度依賴性。
3.軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)檢測iso-suillin對K562增殖活性的影響
0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h后,克隆形成率依次為39.08±13.13、25.8±
20、11.91、15.75±5.25、11.67±8.80(%)組間差異顯著;克隆大小依次為1.88±0.17、1.88±0.30、1.15±0.07、0.77±0.30(mm)。結(jié)果表明:隨iso-suillin濃度增加,克隆形成率明顯降低且克隆的面積變小。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測iso-suillin對K562細(xì)胞周期分布的影響
K562細(xì)胞在0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理24 h后,
21、G1期細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為48.31±2.52%、60.27±3.67%、61.07±3.59%和67.70±2.19%;S期細(xì)胞分別為34.48±1.57%、17.98±3.09%、21.33±5.89%和18.18±7.58%;G2期細(xì)胞分別為17.22±1.76%、21.74±0.59%、17.60±2.60%和14.12±5.56%。隨著藥物濃度的增加G1期細(xì)胞所占比例明顯增加(P<0.02);S和G2所占比例下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
22、。
5.Western blot檢測iso-suillin對K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
用0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin處理K562細(xì)胞24 h,提取總蛋白,用Western Blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化情況,結(jié)果如下:與內(nèi)參蛋白β-actin比較, cyclinD相對含量為0.8072±0.0134、0.8098±0.0431、0.7388±0.0594、0.6
23、954±0.0296; CDK4分別為0.0216±0.0003、0.0202±0.0009、0.0095±0.0006、0.0038±0.0004;PCNA為0.1256±0.0027、0.0573±0.0016、0.0505±0.0026、0.0468±0.0013;p-RB1.4254±0.0358、0.7835±0.0485、0.8632±0.0399、0.2117±0.0276;E2F-10.4987±0.0423、0.275
24、4±0.0099、0.2568±0.0119、0.0419±0.0005;p210.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019;p380.76410.0149、0.8479±0.0251、0.7765±0.0198、0.8378±0.0667;p38(phospho Thr180/Tyr182)0.1859±0.0025、0.1144±0.0052、0.0982±0.006
25、1、0.0911±0.0113,隨iso-suillin濃度的增加K562細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白cyclinD、CDK4、PCNA和E2F-1的相對含量逐漸減少,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制蛋白p21的相對含量明顯升高,但p38的磷酸化程度在iso-suillin作用于K562細(xì)胞24 h明顯降低(P<0.05)。
用5.48μM iso-suillin作用于K562細(xì)胞0、3、6、12、24 h,提
26、取總蛋白, western測得p-p38相對含量為0.0050±0.0003、0.0411±0.0020、0.0133±0.0005、0.0036±0.0013、0.0103±0.0006;γ-H2AX的相對含量分別為0.0295±0.0032、0.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019。結(jié)果顯示iso-suillin作用于K562細(xì)胞后,p38的磷酸化程度先升后降在3
27、 h時(shí)最高,γ-H2AX的相對含量逐漸升高在6 h后顯著升高。
6.K562細(xì)胞p53基因突變驗(yàn)證
K562細(xì)胞中p53基因發(fā)生移碼突變,在p53蛋白編碼區(qū)序列(CDS)的406和407位點(diǎn)插入了一個(gè)鳥嘌呤核糖核苷酸,導(dǎo)至CDS序列的442-444位點(diǎn)提前出現(xiàn)終止密碼子TAG;用western bot無法檢測到正常p53蛋白表達(dá),如果p53突變體被表達(dá),其分子量大約15 Kda,但該突變體蛋白未被檢測到。
28、7.P38抑制劑處理后iso-suillin對K562細(xì)胞抑制率、克隆形成率及細(xì)胞周期分布的影響
對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細(xì)胞的增殖抑制率分別為0、6.02±3.63、20.35±3.78、36.33±15.76(%);克隆形成率為36.83±4.09、17.33±11.7、7.58±2.48、2.71±1.87(%)。與對照組相比,處理組細(xì)胞增殖
29、都受到了不同程度的抑制作用,但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細(xì)胞相比,SB203580+iso-suillin細(xì)胞增殖抑制作用明顯減弱,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)測得對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組K562細(xì)胞的周期分布情況:G0/G1所占比例分別為39.26±1.17、43.53±0.97、44.00±1.24、65
30、.22±4.74(%);S期32.26±2.60、25.14±2.82、26.43±4.21、18.95±3.47(%);G2期28.47、1.43±31.33、1.86、29.58±2.98、15.83±1.28(%)。與對照組相比,處理組 G0/G1期細(xì)胞比例都有所增加,但SB203580+iso-suillin與iso-suillin處理組細(xì)胞相比,SB203580+iso-suillin組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)
31、意義(P<0.05)。
8.P38抑制劑處理后iso-suillin對K562細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
Iso-suillin加藥3 h后,對照組和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin處理組 K562細(xì)胞中相應(yīng)蛋白表達(dá)量為:p21相對含量為0.4984±0.0087、0.3296±0.0603、0.2091±0.0183、1.1401±0.023;p-p38蛋白的相對含
32、量分別為0.3300±0.0052、0.1298±0.0163、0.1298±0.0164、0.1205±0.0054、0.6562±0.0312。發(fā)現(xiàn)加入p38抑制劑SB203580后p38磷酸化程度和p21相對含量明顯降低;加SB203580后,SB203580+iso-suillin處理組細(xì)胞p38磷酸化程度和p21含量相對iso-suillin處理組明顯降低,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:
1.Is
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