二氫楊梅素對(duì)人白血病Jurkat細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制.pdf

1、目的:探討二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）對(duì)人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并從mTOR/自噬途徑的角度探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞，用含不同濃度（20、40、60、80和100mg/L）的DMY和5％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞12、24和48小時(shí)。用60mg/L的DMY和10mmol/L細(xì)胞自噬抑制劑3

2、-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）共同處理Jurkat細(xì)24小時(shí)。四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，采用透射電鏡觀察Jurkat細(xì)胞自噬體形成等超微結(jié)構(gòu)。采用Western Blot檢測(cè)Jurkat細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3和p62的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)定量PCR和West

3、ern Blot檢測(cè)Jurkat細(xì)胞中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammaliantarget of rapamycin,mTOR）mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.DMY顯著抑制了Jurkat細(xì)胞的增殖(P﹤0.05)，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，在12、24和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的藥物半數(shù)抑制濃度(50% inhibition concentration,IC50)逐漸降低，IC50分別為217、155和92mg/L，最佳作用濃度

4、和時(shí)間是60mg/L處理24小時(shí)。
　　2.DMY能以劑量和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡(P﹤0.05)，最佳作用濃度和時(shí)間是60mg/L處理24小時(shí)。
　　3.對(duì)照組Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)正常，呈不規(guī)則形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜和核仁清晰可見(jiàn)，核染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)大量的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器，可見(jiàn)少量自噬泡或自噬體。DMY(60mg/L)處理24小時(shí)組Jurkat細(xì)胞多呈不規(guī)則形，細(xì)

5、胞核稀疏成網(wǎng)狀，細(xì)胞核內(nèi)可發(fā)現(xiàn)部分染色質(zhì)固縮，部分線粒體出現(xiàn)空泡化，其他細(xì)胞器部分腫脹，少部分細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體和單層膜的自噬溶酶體，其中包含有處在不同降解階段的胞漿成分或細(xì)胞器；與對(duì)照組比較，DMY(60mg/L)處理24小時(shí)組細(xì)胞中雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體和單層膜的自噬溶酶體的數(shù)量及自噬泡占胞質(zhì)總面積的百分率顯著性增加(P﹤0.05)。
　　4.與對(duì)照組比較，DMY(60mg/L)處理

6、24小時(shí)組Jurkat細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著增加，而p62的表達(dá)顯著降低(P﹤0.05)。
　　5.與對(duì)照組比較，DMY(60mg/L)處理24小時(shí)組Jurkat細(xì)胞中mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低(P﹤0.05)。
　　6.自噬抑制劑3-MA部分取消了DMY抑制Jurkat細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用(P﹤0.05)。
　　結(jié)