胰島素作用下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾在NAFLD中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的：非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精以及其他明確病理?yè)p傷因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積的病理綜合征。研究表明胰島素抵抗在NAFLD眾多致病因素中具有重要作用，并貫穿（或參與）NAFLD發(fā)生發(fā)展的始終。因此探索胰島素對(duì)脂質(zhì)從頭合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)深入了解NAFLD的發(fā)病機(jī)理有重要的意義。
　　固醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白（Stero responsive e

2、lement binding protein,SREBP-1c）是胰島素依賴(lài)調(diào)控脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白）（Carbohydrate responsive element binding protein,ChREBP）不僅是葡萄糖依賴(lài)也是胰島素依賴(lài)的調(diào)控脂質(zhì)合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在胰島素刺激下SREBP-1c和ChREBP均能誘導(dǎo)脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶-脂肪酸合成酶（Fatty acids synthase,FASN

3、）轉(zhuǎn)錄激活。FASN基因被過(guò)度轉(zhuǎn)錄激活是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變的重要基礎(chǔ)。正常狀態(tài)下染色質(zhì)處于致密狀態(tài)會(huì)阻止基因轉(zhuǎn)錄激活，組蛋白修飾能在不改變DNA序列的情況下，通過(guò)影響組蛋白與DNA之間的相互作用，即改變?nèi)旧|(zhì)的疏松或凝集轉(zhuǎn)態(tài)，為信號(hào)分子與靶基因結(jié)合提供空間，最終起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。在胰島素刺激下SREBP-1c及ChREBP介導(dǎo)的FASN轉(zhuǎn)錄激活的過(guò)程中也必然存在組蛋白修飾，但是其具體種類(lèi)及機(jī)制仍不清楚。本研究對(duì)由FASN基因過(guò)度轉(zhuǎn)錄

4、激活而導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪變具有重要意義，亦為NAFLD潛在的治療靶點(diǎn)提供新的證據(jù)。
　　鑒于此，本課題首先建立高濃度胰島素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變模型，并在此基礎(chǔ)上探討高濃度胰島素對(duì)肝細(xì)胞FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響，以及FASN基因轉(zhuǎn)錄激活與這些組蛋白修飾的關(guān)系，SREBP-1c和ChREBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的作用。最后我們深入研究了組蛋白乙?；揎椚绾斡绊懜渭?xì)胞FASN基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而導(dǎo)致肝細(xì)

5、胞脂變的可能機(jī)制。
　　方法：
　　一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子肝細(xì)胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系
　　1、胰島素刺激HepG2和原代肝細(xì)胞的最佳濃度。
　　按照文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)置胰島素濃度：0.5、0.75、1.0、1.25uM分別刺激HepG2和原代肝細(xì)胞24h，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　2、胰島素對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響。
　　最佳濃度胰島素干預(yù)HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞24和48

6、h后用TG酶法檢測(cè)TG含量，油紅O染色檢測(cè)脂滴沉積。
　　3、胰島素對(duì)肝細(xì)胞FASN基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響。
　　最佳濃度胰島素分別刺激HepG2、原代肝細(xì)胞0、1、2、4、8、12、16、24h，或胰島素刺激HepG2、原代肝細(xì)胞12h或4h后撤除胰島素刺激，在胰島素刺激或撤除刺激的0、1、2、4、8、12、16、24h，分別用qRT-PCR檢測(cè)FASN mRNA表達(dá)，用Western-blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)FASN蛋白表達(dá)。

7、
　　4、胰島素刺激HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞后FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)重塑事件。
　　根據(jù)胰島素刺激或撤除胰島素刺激后FASN轉(zhuǎn)錄時(shí)間譜，選取FASN mRNA開(kāi)始增加或者降低的時(shí)間點(diǎn)作為研究染色質(zhì)重塑的時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)，利用抗組蛋白H3K4甲基化、H3K9甲基化、H4K20甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙?；贵w、比

8、較胰島素作用對(duì)FASN基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5’上游-2000bp、tss、第二外顯子（exon2）組蛋白甲基化、磷酸化、乙?；揎椀挠绊憽?br>　　二、SREBP-1c或ChREBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響
　　1、胰島素刺激對(duì)肝細(xì)胞SREBP-1c、ChREBP蛋白表達(dá)的影響最佳濃度胰島素刺激HepG2和原代肝細(xì)胞0、1、2、4、8、12、16、24h，用Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞SREBP-1

9、c及ChREBP表達(dá)水平。
　　2、胰島素刺激肝細(xì)胞后SRBEP-1c、ChREBP核轉(zhuǎn)位最佳濃度胰島素刺激肝細(xì)胞0h、24h，免疫熒光檢測(cè)SREBP-1c、ChREBP細(xì)胞內(nèi)定位。
　　3、抑制肝細(xì)胞SREBP-1c或ChREBP表達(dá)對(duì)FASN表達(dá)的影響siRNA-SREBP-1c、siRNA-ChREBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞，shRNA-SREBP-1c、shRNA-ChREBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。Wester

10、n blot檢測(cè)ChREBP、SREBP-1c以及FASN蛋白表達(dá)。
　　4、抑制肝細(xì)胞SREBP-1c或 ChREBP表達(dá)對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞SREBP-1c-SRE、ChREBP-ChORE結(jié)合水平的影響siRNA-SREBP-1c、siRNA-ChREBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，shRNA-SREBP-1c、shRNA-ChREBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。ChIP比較空白組、陽(yáng)性對(duì)照組（最佳濃度胰島素刺激）、轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)

11、照組（轉(zhuǎn)染pEX3-scramble質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照慢病毒后用胰島素刺激）FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域SREBP-1c-SRE、ChREBP-ChORE結(jié)合水平。
　　5、SREBP-1c和ChREBP對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞FASN基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響siRNA-SREBP-1c、siRNA-ChREBP質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，shRNA-SREBP-1c、shRNA-ChREBP慢病毒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞。ChIP比較空白組、陽(yáng)性對(duì)

12、照組（最佳濃度胰島素刺激）、轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEX3-scramble質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照慢病毒后用胰島素刺激）FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾事件。
　　三、組蛋白乙?；揎棇?duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞脂肪變性的影響HepG2、原代肝細(xì)胞分為空白組、胰島素組（胰島素刺激HepG2細(xì)胞12h，刺激原代肝細(xì)胞8h）、胰島素+組蛋白乙?；敢种苿℉istong acetyltransrease，HAT）組。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選

13、取5uM作為Garcionl處理肝細(xì)胞最適濃度。ChIP檢測(cè)FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙?；揎椧约癝REBP-1c-SRE、ChREBP-ChoRE結(jié)合水平。Western-blot檢測(cè)FASN、SREBP-1c、ChREBP表達(dá)水平。HepG2和原代肝細(xì)胞用胰島素刺激48h以及Garcionl與胰島素共刺激48h后油紅O檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴。
　　結(jié)果：
　　一、胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子肝細(xì)胞區(qū)組蛋白修飾、基因轉(zhuǎn)錄

14、與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的關(guān)系
　　1、MTT結(jié)果顯示：1.25uM為胰島素刺激HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞最適濃度。
　　2、Western blot結(jié)果顯示：胰島素刺激下，HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞內(nèi)FASN蛋白水平隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加（P＜0.05）。
　　3、TG及油紅O測(cè)定顯示：1.25uM胰島素刺激HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞24及48h后，肝細(xì)胞內(nèi)TG及脂滴含量均較0h明顯增加（P＜0.05）。證明胰島素誘導(dǎo)肝

15、細(xì)胞脂肪變模型構(gòu)建成功。
　　4、qRT-PCR結(jié)果顯示：當(dāng)1.25uM胰島素刺激HepG2細(xì)胞4h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)FASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯增高，至12h時(shí)，F(xiàn)ASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)峰值（P＜0.05）。1.25uM胰島素刺激HepG2細(xì)胞12h時(shí)撤除胰島素刺激，在撤除胰島素刺激1h時(shí)，F(xiàn)ASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降（P＜0.05）。當(dāng)1.25uM胰島素刺激原代肝細(xì)胞1h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)FASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平較

16、0h明顯增高，至4h時(shí)，F(xiàn)ASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)峰值（P＜0.05）。1.25uM胰島素刺激原代肝細(xì)胞4h時(shí)，撤除胰島素刺激，在撤除胰島素刺激1h時(shí)，F(xiàn)ASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平較0h明顯下降（P＜0.05）。由于染色質(zhì)重塑事件一般發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄早期，因此我們選擇胰島素刺激 HepG2細(xì)胞4h、撤除胰島素刺激1h；胰島素刺激原代肝細(xì)胞1h、撤除胰島素刺激1h，作為研究胰島素介導(dǎo)的FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)。

17、　　5、ChIP結(jié)果顯示：胰島素分別刺激HepG2或原代肝細(xì)胞4h或1h后，與0h相比，此時(shí)FASN mRNA轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)明顯上調(diào)，F(xiàn)ASN基因啟動(dòng)子區(qū)域tss位點(diǎn)H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙?；4乙?；斤@著升高（P＜0.05），而 H3K9三甲基化、H4K9三甲基化水平下降（P＜0.05）。-2kb以及exon2位點(diǎn)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。胰島素分別刺激HepG2和原代肝細(xì)胞12h和4h后撤除刺激，相比0h，在撤

18、除刺激1h后FASN mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，F(xiàn)ASN基因啟動(dòng)子區(qū)域tss位點(diǎn)H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙酰化水平降低，H3K9三甲基化、H4k20三甲基化水平明顯升高（P＜0.05）。-2kb和exon2位點(diǎn)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。
　　二、SREBP-1c或ChREBP對(duì)胰島素刺激下FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾的影響
　　1、Western-blot結(jié)果顯示：胰島素刺激HepG2或原代

19、肝細(xì)胞后，SREBP-1c及ChREBP蛋白水平明顯升高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增加。在HepG2細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)在8h開(kāi)始升高，ChREBP表達(dá)在4h開(kāi)始升高。在原代肝細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)在1h開(kāi)始升高，ChREBP表達(dá)在2h開(kāi)始升高。
　　2、Western-blot結(jié)果顯示：抑制HepG2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞中SREBP-1c或ChREBP表達(dá)后，即使分別再予12h及4h的胰島素刺激，SREBP-1c或ChREB

20、P抑制組FASN蛋白表達(dá)水平仍較胰島素刺激組明顯受抑制。說(shuō)明胰島素需通過(guò)SREBP-1c或ChREBP調(diào)控FASN的表達(dá)。
　　3、免疫熒光結(jié)果顯示：1.25uM胰島素刺激HepG2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞各24h后，細(xì)胞核中的綠色熒光較正常組明顯增多，即胰島素刺激促進(jìn)SREBP-1c、ChREBP由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核中。
　　4、ChIP結(jié)果顯示：在1.25uM胰島素刺激下，抑制HepG2和原代肝細(xì)胞SREBP-1c或ChREBP蛋白

21、表達(dá)，與胰島素刺激組相比，F(xiàn)ASN基因SREBP-1c-SRE、ChREBP-ChoRE結(jié)合水平均明顯降低（P＜0.05）。
　　5、ChIP結(jié)果顯示：抑制HepG2和原代肝細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)，F(xiàn)ASN基因tss、SRE位點(diǎn)H3乙?；癏4乙酰化水平較陽(yáng)性對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）。而H3K4三甲基化修飾則無(wú)明顯下降。而抑制HepG2和原代肝細(xì)胞中ChREBP表達(dá)FASN基因tss、ChORE位點(diǎn)H3乙?；癏4乙?；?/p>

22、水平較陽(yáng)性組明顯下降（P＜0.05）。H3K4三甲基化同樣無(wú)明顯下降。同時(shí)抑制SREBP-1c和ChREBP，F(xiàn)ASN基因tss位點(diǎn)H3及H4乙?；较陆递^單獨(dú)抑制SREBP-1c或ChREBP下調(diào)更加明顯。結(jié)果提示FASN基因啟動(dòng)子區(qū) H3K4修飾水平并非僅受SREBP-1c和ChREBP影響，而H3和H4乙?；揎椝絼t主要受SREBP-1c和ChREBP影響。且SREBP-1c及ChREBP協(xié)同參與了胰島素刺激下肝細(xì)胞FASN基

23、因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾。
　　三、組蛋白乙酰化對(duì)胰島素刺激下肝細(xì)胞脂肪變的影響
　　1、ChIP結(jié)果顯示：在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性，能顯著下調(diào)胰島素誘導(dǎo)的HepG2及原代肝細(xì)胞FAS基因啟動(dòng)子區(qū)域H3、H4乙酰化水平（P＜0.05）。
　　2、ChIP結(jié)果顯示：在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性，能降低HepG2細(xì)胞及原代肝細(xì)胞ChREBP-ChORE結(jié)合水平（P＜0.05）。
　　3、Western-blo

24、t結(jié)果顯示：在胰島素刺激下同時(shí)抑制HAT活性，與胰島素刺激組相比較，抑制組肝細(xì)胞FASN蛋白上調(diào)幅度明顯降低，而SREBP-1C和ChREBP表達(dá)水平則無(wú)明顯改變。
　　4、油紅染色顯示：在胰島素刺激下同時(shí)抑制 HAT活性，細(xì)胞內(nèi)脂滴較單純胰島素刺激組減少。
　　結(jié)論:1.25uM胰島素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞脂肪沉積。胰島素刺激能促進(jìn)FASN基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)伴隨FASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3S10

25、磷酸化、H3乙?；4乙?；撸琀3K9及H4K20三甲基化水平降低，胰島素撤除后FASN基因轉(zhuǎn)錄降低，F(xiàn)ASN基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4三甲基化、H3乙酰化、H4乙?；档?，H3K9及H4K20三甲基化水平升高。胰島素通過(guò)調(diào)控SREBP-1c以及ChREBP表達(dá)來(lái)影響FASN基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而SREBP-1c或ChREBP則通過(guò)增強(qiáng)與FASN基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域SRE或ChORE結(jié)合并誘導(dǎo)FASN基因H3、H4乙?；?，發(fā)揮對(duì)FASN