HCV蛋白NS5A在胰島素信號通路中的作用.pdf

1、研究背景
　　 丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是一種主要經(jīng)過血液傳播的嗜肝性病毒，其慢性感染可引起慢性丙型肝炎，進而可導致肝硬化或肝細胞癌。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者約1.7億（感染率約為3％），我國HCV感染率為3.2％，且感染率仍有逐年上升的趨勢。然而HCV感染治療的手段有限，主要依靠α-干擾素，及以α-干擾素為主體再附加其他輔助手段。目前也還沒有有效疫苗，使得HCV感染成為一個重

2、要的社會問題。盡管科學研究受到廣泛的重視，但HCV感染的分子機制還有許多不清楚，從而影響了臨床丙肝病毒感染的治療手段的發(fā)展。
　　 HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬。HCV編碼多個結構蛋白和非結構蛋白，其中NS5A是一個重要的非結構蛋白。它有兩種磷酸化形式:p56和p58，它們均可以與宿主內(nèi)多種信號蛋白發(fā)生作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)NS5A與胰島素信號通路（Insulin/PI3K/Akt通路）之間存在關聯(lián)。而胰島素信號通路在細胞代謝、

3、細胞周期調(diào)控、細胞生長凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。這意味著NS5A可能通過改變胰島素信號通路，從而在HCV感染過程中發(fā)揮其作用。在正常情況下這條信號通路受到嚴格的調(diào)控，其穩(wěn)態(tài)的變化與不同疾病的發(fā)生相聯(lián)系。當Insulin/PI3K/Akt信號通路中的關鍵分子PI3K（調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110）、Akt等編碼基因的功能發(fā)生改變，可導致細胞代謝障礙[2-3]、細胞周期及細胞生長凋亡紊亂而引起各種疾病，例如腫瘤。HCV蛋白

4、NS5A可結合并激活PI3K，導致下游分子絲氨酸/蘇氨酸激酶，即Akt/蛋白激酶B的激活，破壞了信號通路在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，導致HCV感染的細胞持續(xù)增殖而引發(fā)一系列病理效應，包括抗病毒抗性的產(chǎn)生[4-5]、肝細胞癌發(fā)生等[6-7]。
　　 PTEN是除p53之后一個重要的抑癌基因。該基因功能的降低與多種組織的腫瘤發(fā)生有關。曾有研究報道丙肝導致的肝癌中，PTEN的功能降低。而PTEN是胰島素信號的主要負調(diào)節(jié)因子，抑制Insulin/PI

5、3K/Akt信號，從而與HCV激活Insulin/PI3K/Akt信號作用相對抗。本論文研究了抑癌基因PTEN與細胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的關系，及HCV蛋白NS5A對細胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的破壞作用，顯示了PTEN與NS5A從正反兩個方面影響胰島素信號通路，通過改變該信號通路的穩(wěn)態(tài)，從而影響細胞的命運。
　　 第一部分PTEN對Insulin/PI3K/Akt信號通路穩(wěn)態(tài)的作用
　　 [目的]
　　 既然，丙肝肝癌

6、中，PTEN的功能減弱。因此，我們首先研究PTEN與Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的關系。我們以人肝癌細胞系HepG2為研究模型，用胰島素刺激、或上調(diào)或沉默PTEN的表達等，利用Westernblot技術，從蛋白水平層面研究Insulin/PI3K/Akt信號通路的穩(wěn)態(tài)變化。
　　 [方法]
　　 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞傳代均勻鋪十二孔板，待長至約90％后，予血清饑餓24小時后裂解細胞。裂解細胞前予insuli

7、n刺激10min（胰島素工作濃度為2ul/ml，用無血清DMEM液稀釋）或加入同體積的無血清DMEM培養(yǎng)液作對照，分為insulin刺激組或control組，裂解細胞提取總蛋白，Westernblot蛋白分析法檢測p-Akt蛋白表達水平。
　　 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉染攜帶人野生型PTEN的真核表達質(zhì)粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突變型質(zhì)粒pSvEGFP-C124S兩種不同質(zhì)粒分為兩組，即PTENwt組及P

8、TENC124S組，轉染、血清饑餓同上。兩組均予等量等濃度胰島素刺激10min后裂解細胞，提取總蛋白。Westernblot蛋白分析檢測p-Akt蛋白表達水平。
　　 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉染PTENsiRNA及其controlsiRNA分為兩組，即PTENsiRNA組及control組，轉染、血清饑餓及胰島素刺激同上。轉染共48小時后常規(guī)裂解細胞，提取總蛋白。Westernblot蛋白分析法檢測PTEN及p-Akt

9、兩種蛋白表達水平。
　　 4、所有結果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術平均值±標準誤（M±S.E.M）”表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-SamplesTTest)或兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗，以P值＜0.05視為有顯著性差異。
　　 [結果]
　　 1、Westernblot檢測結果顯示insulin刺激組較control組p-Akt蛋白

10、表達水平顯著提高(P＜0.010)，Westernblot以β-actin作內(nèi)參，兩組灰度比值比分別為0.221±0.136及0.000±0.000。
　　 2、Westernblot檢測結果顯示PTENC124S組較PTENwt組Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分別為0.360±0.141和0.084±0.055，P＜0.05)。
　　 3、Westernblot檢測結果顯示PTENsiRNA組比control組H

11、epG2細胞PTEN蛋白表達水平偏低(P＜0.05)，相應的p-Akt蛋白表達水平卻相對顯著提高(P＜0.005)。
　　 [結論]
　　 1、胰島素可以誘導Insulin/PI3K/Akt信號通路的激活。
　　 2、當Insulin/PI3K/Akt信號通路中某一環(huán)節(jié)如負調(diào)控因子PTEN基因點突變或敲低，可引起下游信號分子Akt活化。
　　 3、在正常情況下Insulin/PI3K/Akt信號通路受到嚴

12、格的調(diào)控，外源性干預使信號通路中任一環(huán)節(jié)受阻或失控，這一穩(wěn)態(tài)將被打破，或過度抑制或過度激活。
　　 第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信號通路中的作用
　　 [目的]
　　 上一部分顯示，PTEN對Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的作用。接著，我們研究NS5A對Insulin/PI3K/Akt的影響。我們將丙肝病毒NS5A質(zhì)粒導入Insulin/PI3K/Akt信號通路活躍的人肝癌細

13、胞系HepG2細胞中，從蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A對于PI3K/Akt通路的調(diào)控作用及其初步機制，為臨床上丙肝慢性遷延、肝細胞癌發(fā)生及抗病毒抗性等方面提供依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、HepG2細胞分別轉染NS5A質(zhì)?；驅φ湛蛰d體，轉染相應質(zhì)粒24小時后血清饑餓。轉染共48小時后胰島素刺激10min即常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。以p-Akt抗體為一抗，Westernblot檢測Akt磷酸化水平。
　

14、　 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉染NS5A質(zhì)?；驅φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組，轉染48小時后常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。采用免疫沉淀法檢測:將NS5A組或control組HepG2細胞總蛋白先與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85多克隆抗體進行免疫沉淀，再以anti-pTyr為Westernblot抗體檢測，比較兩組間p85酪氨酸磷酸化水平。
　　 3、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞根據(jù)轉染NS5A質(zhì)?；驅φ湛蛰d體兩組不

15、同質(zhì)粒分為NS5A組及control組，轉染48小時后常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。采免疫共沉淀法檢測:將NS5A組或control組HepG2細胞總蛋白先與PI3K催化亞基p85多克隆抗體進行免疫沉淀，再以anti-p110為Westernblot抗體檢測，比較兩組間催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85的結合水平。
　　 4、所有結果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術平均值±標準誤（M±S.E.M）”表示。

16、兩組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-SamplesTTest)或兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗，以P值＜0.05視為有顯著性差異。
　　 [結果]
　　 1、Westernblot檢測結果顯示NS5A質(zhì)粒轉染組HepG2細胞p-Akt蛋白水平較control組明顯上調(diào)(灰度比值比分別為0.811±0.131及0.205±0.066，P＜0.002)。
　　 2、免疫沉淀法檢測到NS5

17、A質(zhì)粒轉染組的p85酪氨酸磷酸化水平較control組的高（灰度比值比分別為1.055±0.189及0.479±0.147，＜0.014）。
　　 3、免疫共沉淀法檢測結果顯示NS5A質(zhì)粒轉染組與control組細胞的p85和p110蛋白結合無差異（灰度比值比分別為0.543±0.286及0.195，P＞0.05）。
　　 [結論]
　　 HCV蛋白NS5A可以與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85蛋白相互作用，進而激活Ins