尼古丁上調(diào) NEAT1影響人牙周膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的研究.pdf

1、牙周炎發(fā)生于連接牙體硬組織和牙槽骨的牙周膜中，是牙周支持組織中的一種嚴(yán)重影響口腔健康的疾病，其主要表現(xiàn)為牙周支持組織喪失。吸煙可使牙周炎發(fā)病率升高，加重牙周炎嚴(yán)重程度，同時(shí)降低牙周手術(shù)及非手術(shù)治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，煙草燃燒時(shí)產(chǎn)生的尼古丁可對(duì)人體多個(gè)組織和器官產(chǎn)生不良影響，其中包括牙周組織。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可作為配體，特異性的與人牙周膜細(xì)胞乙酰膽堿受體結(jié)合，參與牙周膜細(xì)胞炎性表達(dá)，但其具體機(jī)制仍不明了。越來(lái)越多的研究表明，lncR

2、NA作為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA，參與了細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，炎性反應(yīng)等方面的調(diào)控，然而關(guān)于lncRNA參與尼古丁引起牙周組織炎性反應(yīng)的報(bào)道較少。由此作者推測(cè)：尼古丁與乙酰膽堿受體結(jié)合后，可通過(guò)影響lncRNA的表達(dá)進(jìn)一步引起牙周組織炎性損傷。本研究旨在探尋lncRNA在吸煙相關(guān)性牙周炎致病機(jī)制中發(fā)揮的作用，為控制并治愈吸煙相關(guān)性牙周炎提供新思路。
　　【目的】
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)探究尼古丁不同濃度和時(shí)間作用下人牙周膜細(xì)胞α7

3、nAChR和lncRNA NEAT1的表達(dá)，NEAT1的表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響及可能作用機(jī)制，探索lncRNA在尼古丁介導(dǎo)的牙周炎致病機(jī)制中的作用。
　　【方法】
　　1、結(jié)合酶消化的改良組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行鑒定。
　　2、分別給予第5代人牙周膜細(xì)胞不同時(shí)間和濃度尼古丁作用，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中NEAT1和α7 nAChR表達(dá)情況，Western Blot檢測(cè)α7 n

4、AChR表達(dá)情況。確定尼古丁引起NEAT1和α7 nAChR表達(dá)改變的最佳作用時(shí)間和濃度。之后給予α7 nAChR激動(dòng)劑尼古丁和/或其抑制劑α-BTX作用，實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NEAT1的表達(dá)差異。
　　3、給予第5代人牙周膜細(xì)胞尼古丁作用后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-ip、IL-6、IL-8和 TNF-α等炎性因子的表達(dá)并用ELISA驗(yàn)證。分別對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA抑制NEAT1表達(dá)及對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒特異性擴(kuò)增NEAT1表

5、達(dá)后給予尼古丁作用，隨后再次觀察炎性因子表達(dá)改變，探索人牙周膜細(xì)胞在尼古丁作用后NEAT1和炎性相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化之間的關(guān)系。
　　4、分別給予第5代人牙周膜細(xì)胞不同時(shí)間和濃度尼古丁作用，通過(guò)Western Blot和免疫熒光檢測(cè)NEAT1結(jié)合蛋白SFPQ和NONO的表達(dá)量及在細(xì)胞核內(nèi)的分布情況。隨后觀察抑制SFPQ/NONO表達(dá)后尼古丁作用下人牙周膜細(xì)胞炎性相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1、體外成功培養(yǎng)人

6、牙周膜細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，人牙周膜細(xì)胞表面，間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105和CD90表達(dá)呈陽(yáng)性，造血系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志CD14和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD31呈陰性。
　　2、尼古丁可上調(diào)人牙周膜細(xì)胞NEAT1的表達(dá)，其最佳作用條件為10_5M尼古丁作用2h。尼古丁上調(diào)α7 nAChR后，NEAT1表達(dá)上升，當(dāng)抑制尼古丁與表達(dá)上調(diào)的α7 nAChR結(jié)合后，NEAT1表達(dá)不變。
　　3、尼古丁作用上調(diào)人牙周膜細(xì)胞NEAT1

7、表達(dá)后，可特異性引起下游IL-8表達(dá)上升；抑制NEAT1表達(dá)后，IL-8表達(dá)隨之下降；過(guò)表達(dá)NEAT1，IL-8表達(dá)隨之上升。
　　4、尼古丁作用人牙周膜細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)蛋白SFPQ和N O N O的表達(dá)量雖沒(méi)有變化，但分布狀態(tài)由彌散變?yōu)榫奂?。相比于單?dú)尼古丁作用，抑制SFPQ后尼古丁作用可使IL-8表達(dá)進(jìn)一步升高，而抑制NONO卻沒(méi)有相似變化。
　　【結(jié)論】
　　成功培養(yǎng)并鑒定人牙周膜細(xì)胞。尼古丁可通過(guò)α7 nACh