免疫炎性反應與帕金森病關系的研究.pdf

1、目的：帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺(DA)能神經(jīng)元大量減少，使紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)。DA和乙酰膽堿之間的相互拮抗作用失調(diào)，而導致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。臨床上以進行性加重的運動緩慢、肌強直、靜止性震顫、姿勢步態(tài)異常等為特征。PD患者黑質(zhì)．DA能神經(jīng)元大量減少的機制目前尚不清楚，但普遍認為與多種因素參與有關，近年來，諸多研究顯示小膠質(zhì)細胞參與的炎癥反應與PD關系密切。小膠

2、質(zhì)細胞激活能釋放腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)等多種細胞毒性物質(zhì)促發(fā)DA能神經(jīng)元變性。PD患者的腦和腦脊液TNF-α升高已得到普遍證實，但作為聯(lián)系神經(jīng)系統(tǒng)和全身其它部分的重要媒介，血液在PD發(fā)生發(fā)展中的作用卻仍很模糊。Dobbs等檢測PD患者血清TNF-α濃度，發(fā)現(xiàn)有姿勢障礙者增高，而癥狀控制者濃度正常，表明TNF-α的分泌與PD的臨床嚴重程度相關。Bessler等由體外實驗測得PD中外周血單核細胞分泌的IL-6、TNF-α也比

3、對照組增高。PD患者外周血單核細胞培養(yǎng)，檢測上清液，結(jié)果IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α明顯低于正常對照。研究結(jié)果有所不同，可能與口服左旋多巴(L-dopa)等藥物治療有關。有研究表明脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可誘導小膠質(zhì)細胞激活，釋放致炎因子(TNF-α、IL-1α等)和細胞毒性因子(NO、活性氧ROS等)導致DA能神經(jīng)元變性，因此常用來模擬機體感染和免疫激發(fā)狀態(tài)。國內(nèi)外已有多人采用L

4、PS黑質(zhì)注射誘導的PD模型進行研究，但DA能神經(jīng)元的毀損情況不甚一致，而且目前尚不清楚外周血TNF-α的變化究竟如何，它能否反映黑質(zhì)DA能神經(jīng)元毀損的情況。本研究旨在通過于大鼠黑質(zhì)內(nèi)立體定向注射LPS造成一炎癥環(huán)境，研究黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的毀損情況及血清TNF-α與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性之間的關系，加深對PD的免疫機制的了解，以期為PD的治療提供新的思路。 方法：將30只健康雌性SD大鼠隨機分為4組， 24h、14d、28d三個組各

5、8只，利用立體定位儀向大鼠右側(cè)的黑質(zhì)致密部注射2μl LPS(5μg/μl，溶于無菌PBS中)，對照組6只，于黑質(zhì)內(nèi)定位注射PBS。除24h組外，各組大鼠自術后7天起行懸空擺動試驗及其他異常行為觀察。在相應時間點，深度麻醉后，自右心耳取血，灌注、固定、包蠟、切片。免疫組化染色觀察DA合成限速酶酪氨酸羥化酶(Tyrosine-hydroxylase，TH)陽性細胞數(shù)在形態(tài)與數(shù)量上隨時間的變化情況。用放射免疫法(RIA)測定各組大鼠血清TN

6、F-μ水平，分析其與黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元損傷的相關性。結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，所有計量資料采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學方法采用兩樣本比較的t檢驗、配對t檢驗、單因素方差分析、q檢驗和直線相關分析。 結(jié)果：術后1周部分大鼠即開始出現(xiàn)弓背、震顫、活動遲緩、少動、嗅探、尾僵直、豎毛、頻繁潔毛、后肢站立等異常行為，少數(shù)大鼠出現(xiàn)自發(fā)性左向旋轉(zhuǎn)行為。14d、28d組的16只鼠中共有14只向左側(cè)擺動的次數(shù)/兩側(cè)總次數(shù)的百分比≥70

7、％視為成功模型。24h時即觀察到右側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元較左側(cè)減少，右側(cè)占左側(cè)的百分比(存留率)為66.0±4.8％，差異有顯著性(P<0.001)，隨著時間的延長，右側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元逐漸減少，24h、14d、28d和PBS組分別為71.3±5.4、50.5±4.1、49.8±14.3、96.6±7.5個/片，24h與14d或28d組比較差異有顯著性(P<0.001)，但14d與28d組比較差異無顯著性(P>0.05)；黑質(zhì)TH陽性神

8、經(jīng)元的存留率，24h、14d、28d三個組間無顯著性差異，同時該三組左側(cè)的黑質(zhì)也有不同程度的神經(jīng)元損傷。24h、14d、28d和PBS組大鼠血清TNF-α水平分別為3.22±0.98fmol/ml、3131±0.97fmol/ml、2.26±0.47fmol/ml、0.42±0.18，mol/ml，24h、14d、28d的與PBS組相比較均有顯著性差異(P<0.001或<0.01)，24h、14d的較28d組為高，但24h、14d、28

9、d之間無顯著性差異(P>0.05)。相關性分析顯示LPS組大鼠的黑質(zhì)TH陽性細胞的存留率與其血清TNF-α水平之間存在負直線相關關系(P<0.01)。 結(jié)論：本研究以LPS作為誘導劑，摸索了LPS誘導的PD的早期動物模型，采用免疫組化和RIA技術研究了PD與免疫炎性反應之間的關系。研究證實：1.黑質(zhì)立體定向注射LPS，可以誘導出類似PD早期的動物模型，為研究PD與炎性反應的關系奠定基礎；2.炎癥導致的TH陽性神經(jīng)元變性呈時間依賴