射頻消融右側(cè)心房神經(jīng)叢對犬靶心房結(jié)構與功能的遠期影響及機制研究.pdf

1、第一部分射頻消融犬右側(cè)心房神經(jīng)叢對靶心房組織結(jié)構和功能的遠期影響
　　研究背景:
　　心房顫動（簡稱房顫，AF）是臨床上最常見的以房性持續(xù)紊亂為特點的快速心律失常，在AF的發(fā)生和維持中，心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)起著重要作用。心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)由內(nèi)在及外在自主神經(jīng)系統(tǒng)構成，心臟表面、大血管附近的神經(jīng)叢(ganglionated plexi，GP)及連接GP的神經(jīng)纖維構成心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng);腦、脊髓及心臟神經(jīng)叢之前的纖維構成心臟外在

2、自主神經(jīng)系統(tǒng)。GP是交感和迷走末梢分布在心臟表明的“集散地”或“整合中心”，包含大量的迷走、交感和中間神經(jīng)元，因其被心臟表明的脂肪組織所包繞又被稱為“脂肪墊”。分布在心臟表面的GP主要有四個，均位于肺靜脈的根部，分別稱為右上GP、右下GP、左上GP、左下GP，GP調(diào)節(jié)和支配心肌神經(jīng)傳導物質(zhì)的釋放，交感和副交感神經(jīng)活性改變及過度增生，引起心房電生理的一系列改變導致AF的發(fā)生。
　　目前AF射頻消融方式主要包括:環(huán)肺靜脈消融、肺靜脈隔

3、離、心房復雜碎裂電位隔離、心房神經(jīng)叢消融。然而，無論何種術式，AF射頻消融的遠期成功率依然不盡人意，單次射頻消融術后房顫遠期復發(fā)率高達11％-50％，約20％-40％的患者需要二次甚至三次射頻消融治療，重復多次消融房顫遠期復發(fā)率仍為7％-24％，隨著手術后時間的延長，復發(fā)率呈上升趨勢，消融遠期效果的不盡人意與消融后AF復發(fā)機制不明有關。關于AF消融術后復發(fā)有多種解釋，其中包括肺靜脈-左心房連接部電傳導的恢復、非肺靜脈起源的房顫觸發(fā)灶、與

4、消融相關的大折返環(huán)形成以及全身和局部的炎癥反應、同時也可能與射頻消融造成心房基質(zhì)的改變，隨之發(fā)生負性電重構與結(jié)構重構有關。心臟功能的維持包括結(jié)構、電生理及神經(jīng)系統(tǒng)的正常支配。心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)是由位于心臟表面、大血管（如肺靜脈）附近的神經(jīng)叢及連接神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維構成。而射頻消融心房神經(jīng)叢時經(jīng)意或不經(jīng)意的會破壞心臟的電生理及結(jié)構功能，引起心房基質(zhì)的改變進一步造成心臟電與結(jié)構的重構，從而介導房顫的復發(fā)。而心房基質(zhì)的改變主要是射頻消融造成的

5、周圍組織水腫、破壞而引起的心房纖維化，進一步導致的以心房內(nèi)徑及收縮舒張功能改變?yōu)橹饕兓男姆拷Y(jié)構重構，已經(jīng)成為AF復發(fā)的主要因素。除此之外，無論何種消融術式，都經(jīng)意或不經(jīng)意間的改變了心房內(nèi)在自主神經(jīng)的分布，引起交感和迷走神經(jīng)纖維活性改變及神經(jīng)再生，參與了消融后遠期AF的復發(fā)，也成為AF復發(fā)的重要機制之一。本研究采用解剖定位及高頻電刺激的方法確定心房右上GP及右下GP，于直視下行心外膜GP消融，觀察消融即刻、術后1月、6月、12月右心房

6、電生理的變化，以及右上GP、右下GP所支配的靶心房組織結(jié)構改變、心房功能及心臟自主神經(jīng)的變化。
　　研究目的:
　　1.觀察對照組、消融后1月、6月、12月心房大小、收縮舒張功能的改變及消融前、消融后即刻、消融1月、6月、12月電生理的變化。
　　2.消融對照組、術后1月、6月、12月靶心房組織的神經(jīng)分布、密度及心房組織超微結(jié)構的改變。
　　3.探究心房結(jié)構、組織改變以及神經(jīng)重構在射頻消融術后影響AF誘發(fā)性的作用

7、及可能機制。
　　研究方法:
　　1.實驗分組及模型建立:
　　(1)分組:32條成年雜種犬，雌雄不限，平均分為4組(n=8)。1組（對照組）右側(cè)第四肋間開胸，制作心包吊籃，暴露心臟不做其他處理。2組-4組為實驗組，右側(cè)第四肋間開胸，制作心包吊籃，暴露右上及右下脂肪墊，并行直視下脂肪墊射頻消融。2組術后觀察1月處死，3組術后觀察6月處死，4組術后觀察12月。
　　(2)射頻消融犬模型建立:戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管

8、并連接呼吸機，給予持續(xù)心電監(jiān)測。于右側(cè)第四肋間開胸，制作心包吊籃，暴露右上及右下脂肪墊。右上脂肪墊的解剖位置為上腔靜脈與右心房的交界處竇房結(jié)尾端，右下脂肪墊位于下腔靜脈與左、右心房的交界處。應用電生理刺激儀對右上及右下脂肪墊行高頻電刺激(20Hz，0.1ms，2-5V)，出現(xiàn)迷走反應即心率明顯減慢或出現(xiàn)房室傳導明顯延長即為脂肪墊所在部位。定位后，在直視下對右上及右下脂肪墊行射頻消融，每次消融能量為20W-30W，消融時間30s-60s。

9、消融過程中給予少量生理鹽水以降低阻抗及對組織的損傷。消融的終點為脂肪墊炭化且體積變小，高頻電刺激脂肪墊區(qū)域迷走反射消失。
　　2.超聲心動圖檢查
　　所有動物在消融前靜息狀態(tài)、消融后1月、6月及12月進行超聲心動圖檢查。犬靜脈麻醉后，仰臥并固定于手術臺上，左胸部及頸部備皮，連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖。用二維超聲及超聲技術于胸骨長軸測量左心房直徑(LAD)，在胸骨旁心尖四腔心切面測量右心房直徑(RAD1，RAD2)。測量左右心房容量:(

10、1)快速排空末期左右房容積(MDV)(2)心室舒張末期左右心房的容積(EDV)。測量心房射血分數(shù)AEF∶ EF=(MDV-EDV)/MDV。
　　以上所有參數(shù)均在竇性心率下測量，均測量三次并取其平均值。
　　3.電生理的檢測
　　分別于右房游離壁、高位右房、右心耳放置三根電極，檢測實驗組(2-4組)所有動物術前、消融即刻的電生理，并分別檢測實驗組消融后1月、6月、12月的有效不應期。有效不應期定義為:以S1300ms，

11、S2200ms，5ms步長遞減刺激，有效不應期（AERP）的定義為第一個不能奪獲心房的S2。房顫由高頻刺激誘發(fā)，成功的房顫誘導定義為持續(xù)快速不規(guī)則的心房率超過30秒。
　　4.標本獲取
　　最后一次電生理檢測之后，對動物施以安樂死，獲取犬距離右上脂肪墊1 cm左右的心房組織。
　　5.免疫組化的檢測
　　應用免疫組化方法檢測靶組織心房組織中神經(jīng)的分布，指標包括酪氨酸羥化酶（交感TH）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(副交感神經(jīng)C

12、HAT)。計算對照組與實驗組的神經(jīng)密度，來反映神經(jīng)重構的情況。
　　6.免疫印跡分析(Western blot)
　　提取組織蛋白，利用western blot檢測蛋白中CHAT、TH、神經(jīng)生長因子(GAP43)的表達，GAPDH作為內(nèi)參。
　　7.電鏡檢查
　　取右心房靶組織區(qū)域1mm3左右大小的組織，固定于2.5％的戊二醛中，4℃2h，磷酸緩沖液洗3次×15min，置于1％俄酸固定，4℃2h，再用0.1M的磷

13、酸緩沖液洗3次，隨后梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋。切片，電鏡下觀察心房肌組織的超微結(jié)構。
　　7.統(tǒng)計學分析
　　所有計量數(shù)據(jù)均用中位數(shù)和四分位數(shù)來表示，包括:超聲指標、電生理、神經(jīng)密度、神經(jīng)蛋白表達，使用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。各部位不同時刻的有效不應期的比較采用廣義估計方程法。其他數(shù)值各組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義（雙側(cè)）。
　　研究結(jié)果:
　　最

14、終29只犬完成全部研究，1組（對照）7只，2組（實驗1月）8只，3組（實驗6月）8只，4組（實驗12月）6只。
　　1.超聲心動圖結(jié)果
　　左心房各指標各個時期均無統(tǒng)計學差異。
　　射頻消融后，與對照組相比RAD、RAD2、RA-MDV和RAEF在一個月時減小(P＜0.05)，但在6月及12月時恢復到消融前水平，無統(tǒng)計學差異。RA-EDV與消融前相比，在消融后各時刻點均無統(tǒng)計學差異。
　　2.心房有效不應期的變化

15、
　　消融后即刻與消融前相比，心房各部位AERP明顯延長（P＜0.001），且這種變化一直維持到消融后1月。消融術后6月-12月AERP恢復至消融前水平(P＞0.05)。
　　3.AF誘發(fā)率
　　術前及術后對照組均未誘發(fā)出AF。2組消融后1月有5只誘發(fā)出AF，3組及4組在消融后6月及12月全部誘發(fā)出AF。
　　4.神經(jīng)密度
　　與對照組相比，消融術后1月右心房靶組織的TH及CHAT的密度明顯降低（P＜0.0

16、1），然而，這種變化在6月及12月時消失，消融后6-12月，TH及CHAT密度恢復到消融前水平。
　　5.神經(jīng)相關蛋白表達量
　　消融組神經(jīng)生長因子GAP43比對照組顯著增加，且隨時間延長呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢。消融后1月，TH及CHAT的蛋白表達比對照組相比明顯降低，但6-12月逐漸恢復至對照組水平。
　　6.電鏡結(jié)果
　　電鏡下，對照組的心肌組織超微結(jié)構為高度有序排列的肌小節(jié)，閏盤清晰可見，胞膜完整。消融后1月

17、組，與對照組相比肌組織的超微結(jié)構異型性明顯。消融后6月及12月組，電鏡下的超微結(jié)構與對照組相比不規(guī)則，但損傷程度較1月組輕。然而，間質(zhì)纖維化隨著消融后時間的延長程度逐漸加。
　　結(jié)論:
　　1.心房神經(jīng)叢消融遠期引起靶心房結(jié)構、電生理及神經(jīng)重構的改變，且房顫誘發(fā)性增加。
　　2.心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構是神經(jīng)叢消融犬遠期房顫誘發(fā)性增加的重要機制。
　　關鍵詞:射頻消融;電生理;神經(jīng)重構;心臟超聲;超微結(jié)構
　　

18、第二部分lncRNA參與神經(jīng)叢消融后遠期心臟自主神經(jīng)重構的機制研究
　　研究背景:
　　射頻消融術后心房自主神經(jīng)重構是如何發(fā)生的，目前尚不清楚。不完全的心房去神經(jīng)化、不同消融術式對神經(jīng)損傷程度的差異、消融過程中的高頻刺激引起的神經(jīng)再生以及消融術后血液中神經(jīng)生長因子的表達增加等，但并不能很好解釋射頻消融術后房顫復發(fā)的神經(jīng)重構機制。近年來，分子生物學技術的迅速發(fā)展已滲透到各個學科，生物芯片及高通量測序技術的出現(xiàn)為現(xiàn)代醫(yī)學及轉(zhuǎn)化醫(yī)

19、學的發(fā)展提供了強有力的手段。促進了醫(yī)學從“系統(tǒng)、血液、組織和細胞”向“DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其相互作用層次”過渡，為從分子及基因?qū)用娼沂炯膊〉陌l(fā)病機制提供了新的手段。
　　長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄RNA分子，但不具備蛋白編碼功能。之前，這類RNA一直被認為是基因轉(zhuǎn)錄中的“噪音分子”，但越來越多的研究都發(fā)現(xiàn)其在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮了重要作用。非編碼RNA的數(shù)量跟生物的復雜程度有關，這也就

20、可以解釋為什么人與其他生物盡管有相似的蛋白編碼基因，但生物表型卻更復雜。相比于mRNAs，lncRNA的保守型差一些，但其二級結(jié)構及啟動子區(qū)的保守性較好。lncRNAs已被發(fā)現(xiàn)可從表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N生命活動。關于lncRNAs的研究，目前證實有數(shù)種lncRNA參與調(diào)節(jié)可參與神經(jīng)系統(tǒng)、心臟發(fā)育和疾病發(fā)生過程等各種疾病的進程。如參與神

21、經(jīng)元的退化、腦發(fā)育、外周神經(jīng)的損傷與修復以及神經(jīng)退行性疾病。在心血管疾病中，參與心力衰竭、心肌梗死、心肌病，也可作為心臟疾病的標志物用來診斷疾病的進程。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)lncRNA可參與房顫的心臟自主神經(jīng)重構的發(fā)生發(fā)展過程。但lncRNA是否調(diào)控射頻消融房顫復發(fā)的心房自主神經(jīng)重構機制尚不明確。
　　研究目的:
　　在神經(jīng)叢消融犬急性期和遠期模型上，應用高通量測序檢測消融早期和遠期犬右心房組織中差異表達的lncRNAs，通過

22、生物信息學方法鑒定差異表達的lncRNA與神經(jīng)叢消融后心臟自主神經(jīng)重構相關。
　　研究方法:
　　1.神經(jīng)叢消融犬模型的建立
　　分組:12條成年雜種犬，雌雄不限，平均分為4組(n=3)。1組（對照組）右側(cè)第四肋間開胸，制作心包吊籃，暴露心臟不做其他處理，觀察1月。2組（實驗組）右側(cè)第四肋間開胸，制作心包吊籃，暴露右上及右下脂肪墊，并行直視下脂肪墊射頻消融，術后觀察1月。3組對照組，觀察6月。4組實驗組，觀察6月。

23、r>　　神經(jīng)叢射頻消融方法見第一部分。
　　2.神經(jīng)叢消融后神經(jīng)重構
　　參照第一部分
　　3.高通量測序并驗證
　　獲取1-4組犬右心房組織，用Trizol法提取所有組織中的總RNA并測其OD值，應用二代測序系統(tǒng)檢測lncRNA和mRNA的差異表達，用qRT-PCR的方法對隨機挑選的lncRNA檢測，驗證測序結(jié)果的準確性。
　　4.統(tǒng)計學分析
　　全部計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差來描述，對于測序結(jié)果應用單

24、因素方差分析比較lncRNAs的表達量及qRT-PCR結(jié)果。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義（雙側(cè)）。使用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.高通量測序數(shù)據(jù)分析
　　通過測序結(jié)果分析得到，一共檢測到基因數(shù)目為32705個，新的未知基因有2590個，其中差異表達基因1組與2組比較有160個，1組與3組比較有1615個，3組與4組比較有558個。
　　2.lncRNAs數(shù)據(jù)分析
　　

25、測序結(jié)果顯示，共檢測到lncRNAs7596個，其中新預測到的lncRNAs有3356個。差異表達的lncRNA，1組與2組比較有11個，1組與3組比較有33個，3組與4組比較有36個。
　　3.驗證結(jié)果
　　隨機挑選6個全新的lncRNA，qRT-PCR結(jié)果證實測序結(jié)果真實可靠。
　　結(jié)論:
　　神經(jīng)叢消融犬模型中，存在一系列差異表達的lncRNAs，且差異表達的lncRNAs參與神經(jīng)叢消融犬房顫易誘發(fā)的心臟自