KLK1轉(zhuǎn)染BMSCs聯(lián)合黃芪注射液對(duì)急性心肌梗死大鼠模型心肌超微結(jié)構(gòu)和鉀離子通道蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的與意義：觀察組織激肽釋放酶1（Kallikrein，KLK1）誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）移植聯(lián)合黃芪注射液對(duì)心肌梗死大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)、鉀離子通道蛋白和組織激肽型受體B2的影響。
　　方法：從SPF級(jí)Wistar雄性大鼠180±20g中隨機(jī)抽取20只，隨機(jī)分為正常組和假手術(shù)組（每組各10只）。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心梗模型，將造模成

2、功的70只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為：模型組、BMSCs組、陰性對(duì)照組、BMSCs+5-AZA組（陽(yáng)性對(duì)照組）、BMSCs+KLK1組、BMSCs+黃芪組、BMSCs+KLK1+黃芪組，共7組，每組10只。細(xì)胞移植為將大鼠BMSCs分別加入KLK1腺病毒或5-氮雜胞苷（5-azaCytidine，5-AZA）誘導(dǎo)液，造模成功后14d，在梗死心肌周圍選擇4個(gè)點(diǎn)，注射各組細(xì)胞。黃芪注射液（劑量為0.66mL/0.2kg·d）行腹腔注射，于

3、細(xì)胞移植后第3d進(jìn)行，1次/日，連續(xù)7d。BMSCs組、BMSCs+5-AZA組、BMSCs+KLK1組，術(shù)后3d，行腹腔注射等黃芪注射液體積的生理鹽水。陰性對(duì)照組，造模后第14d，二次開胸，在梗死區(qū)僅注射細(xì)胞培養(yǎng)液。
　　各組干預(yù)4w后取材，采用電子顯微鏡觀察心臟病理切片超微結(jié)構(gòu)；采用RT-PCR法檢測(cè)心臟組織KLK1、激肽型B2型受體m RNA表達(dá)情況；Western Blott-ing技術(shù)檢測(cè)心臟組織KLK1、緩釋肽B2型受

4、體、鉀離子通道Kv1.2和Kv1.5蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.電鏡結(jié)果：正常組、假手術(shù)組：心肌肌原纖維排列整齊、連續(xù)，A帶、I帶、H帶、Z線、M線清晰可見，閏盤呈階梯狀，肌原纖維之間排列著許多線粒體。模型組、陰性對(duì)照組：梗死的心肌肌原節(jié)縮短，I帶消失，A帶肌絲不整齊，H帶、M線消失，線粒體腫脹。BMSCs移植組、BMSCs+黃芪組：病理性改變較輕，并可見幼稚的細(xì)胞，胞核大，染色質(zhì)顆粒細(xì)而均勻，以常染色質(zhì)為主，核周

5、有線粒體、核糖體，可見由肌微絲剛形成的小肌原節(jié)和發(fā)育程度不同的肌原纖維,考慮為移植的B MSCs細(xì)胞分化而來(lái)，周圍有較多的毛細(xì)血管，部分可見與周圍正常心肌形成縫隙連接。BMSCs+KLK1組：在電鏡觀察中還發(fā)現(xiàn)有外來(lái)細(xì)胞與心肌細(xì)胞形成緊密的縫隙連接，類似閏盤結(jié)構(gòu)。而在心肌中，一般只有心肌細(xì)胞之間能夠形成緊密的縫隙連接。BMSCs+5-AZA組：有的外來(lái)細(xì)胞形態(tài)介于成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞，內(nèi)也有肌絲樣結(jié)構(gòu)存在。BMSCs+KLK1+黃芪組：

6、觀察在瘢痕中有外來(lái)移植細(xì)胞存在：有的細(xì)胞較長(zhǎng)，胞核大，兩邊鈍圓，類似心肌細(xì)胞的橢圓形核(成纖維細(xì)胞，其核呈梭形)，內(nèi)常染色質(zhì)與異染色質(zhì)共存，并且常染色質(zhì)比例較高，細(xì)胞漿不豐富，內(nèi)有線粒體與較多剛發(fā)育的肌絲，排列不規(guī)則。
　　2.KLK1 mRNA含量表達(dá)：與BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的KLK1 mRNA含量表達(dá)水平均上調(diào)；與BMSCs＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組的KLK1 mRNA含量表達(dá)

7、水平上調(diào)。與BMSCs＋KLK1＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組mRNA含量表達(dá)水平上調(diào)，BMSCs＋黃芪組的mRNA含量表達(dá)水平下調(diào)；與BMSCs＋5-AZA組比較，BMSCs＋KLK1組的KLK1 mRNA含量表達(dá)水平上調(diào)；而BMSCs＋黃芪組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　KLK1蛋白表達(dá)：與BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的KLK1蛋白含量表達(dá)水平均上調(diào)；與BMSCs＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK

8、1組的KLK1蛋白相對(duì)表達(dá)量水平上調(diào)；與BMSCs＋KLK1＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組的蛋白含量表達(dá)水上調(diào)，而BMSCs＋黃芪組的蛋白表達(dá)量較低；與BMSCs＋5-AZA組相比較，BMSCs＋KLK1組的KLK1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，BMSCs＋黃芪組的KLK1蛋白含量表達(dá)水平下調(diào)。
　　3.緩釋肽B2型受體mRNA的表達(dá):與BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的緩釋肽B2 mRNA含量表達(dá)水平均上調(diào)

9、；與BMSCs＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組緩釋肽B2 mRNA含量水平上調(diào)明顯；與BMSCs＋KLK1＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組緩釋肽B2 mRNA含量表達(dá)水平上調(diào)，BMSCs＋黃芪組差異無(wú)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與BMSCs＋5-AZA組比較，BMSCs＋KLK1組的緩釋肽B2 mRNA含量表達(dá)水平上調(diào)，BMSCs＋黃芪組的緩釋肽B2 mRNA含量表達(dá)水平下調(diào)。
　　緩釋肽B2蛋白的表達(dá):與BMSCs組比較，BMSCs

10、＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的緩釋肽B2 mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)水平均上調(diào)；與BMSCs＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組緩釋肽B2蛋白相對(duì)表達(dá)量水平上調(diào)明顯；與BMSCs＋KLK1＋黃芪組相比較，BMSCs＋黃芪組的緩釋肽B2蛋白含量表達(dá)平下調(diào)明顯，而BMSCs＋KLK1組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與BMSCs＋5-AZA組比較，BMSCs＋黃芪組的緩釋肽B2蛋白含量表達(dá)平下調(diào)明顯，而BMSCs＋KLK1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、>　　4.鉀離子通道蛋白的表達(dá)：
　　Kv1.2蛋白的表達(dá):與BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的Kv1.2蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)水平均上調(diào)；與BMSCs＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組Kv1.2蛋白表達(dá)水平上調(diào)明顯；與BMSCs＋KLK1＋黃芪組比較，BMSCs＋黃芪組比較的Kv1.2蛋白含量表達(dá)下調(diào)明顯，BMSCs＋KLK1組的Kv1.2蛋白含量表達(dá)下調(diào)明顯；與BMSCs＋5-AZA組比較，BMSCs＋

12、黃芪組的Kv1.2蛋白含量表達(dá)下調(diào)明顯，BMSCs＋KLK1組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　Kv1.5蛋白的表達(dá):與BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組和BMSCs＋黃芪組的Kv1.5蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)水平均上調(diào)；與黃芪＋BMSCs組比較，BMSCs＋KLK1組的Kv1.5蛋白表達(dá)量上調(diào)明顯；進(jìn)一步分別比較，與BMSCs＋KLK1＋黃芪組比較，BMSCs＋KLK1組蛋白表達(dá)量上調(diào)明顯，BMSCs＋黃芪組蛋白表達(dá)量水平下調(diào)明顯；與BM

13、SCs＋5-AZA組比較，BMSCs＋KLK1組蛋白表達(dá)量水平上調(diào)明顯，BMSCs＋黃芪組的蛋白表達(dá)量水平下調(diào)明顯。
　　結(jié)論：
　　1.KLK1對(duì)心肌梗死后的心臟組織恢復(fù)有積極治療作用；
　　2.KLK1轉(zhuǎn)染BMSCs對(duì)心肌梗死后心功能的恢復(fù)起著相當(dāng)重要的作用，但是聯(lián)合黃芪注射液兩者之間無(wú)協(xié)同作用；
　　3.5-AZA在治療心肌梗死時(shí)確有療效，但其自身毒性作用不容忽視，甚至毒性作用是妨礙心肌細(xì)胞復(fù)原的因素之一；