LIMK1通過磷酸化Cofilin調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移.pdf

1、神經(jīng)元有序地從室?guī)нw移到邊緣帶形成大腦皮層由內(nèi)而外的六層結(jié)構(gòu)。當(dāng)神經(jīng)元遷移到達(dá)目的地，頂樹突向上延伸到邊緣帶，軸突向下伸至室?guī)亩⑼挥|聯(lián)系。神經(jīng)元遷移是一個(gè)高度有序的過程，對大腦發(fā)育具有重要作用，其依賴于許多細(xì)胞功能，如細(xì)胞形狀、極性和動力。神經(jīng)元遷移障礙會導(dǎo)致很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如癲癇、智力障礙和精神失常。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育依賴于LIMK1的表達(dá)，LIMK1的缺失會導(dǎo)致一種復(fù)雜的發(fā)育疾病，威廉姆斯綜合征，該疾病常伴有精

2、神失常和空間認(rèn)知障礙。LIM激酶家族有兩大成員，LIMK1和LIMK2。LIMK1含有兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域、一個(gè)絲氨酸/脯氨酸富集區(qū)和一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，其參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)的建立、細(xì)胞動力和結(jié)構(gòu)重塑等多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程。LIMK1高表達(dá)于成熟的神經(jīng)元突觸中，在神經(jīng)系統(tǒng)中，LIMK1對軸突生長、小棘形態(tài)和突觸可塑性都至關(guān)重要。海馬錐體神經(jīng)元中超表達(dá)LIMK1會誘導(dǎo)生長錐的形成和軸突的生長。另外，LIMK1可被其上游信號分子Rho和Rac1激活，

3、研究表明無論在體內(nèi)或體外環(huán)境下，ROCK都可通過磷酸化LIMK1的508位的蘇氨酸來激活LIMK1的表達(dá)。作為一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶，LIMK1還可以通過磷酸化Cofilin使其失活來重塑細(xì)胞骨架。關(guān)于LIMK1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突生長，小棘形態(tài)及突觸可塑性等方面的研究已有很多，然而LIMK1在神經(jīng)元遷移過程中扮演什么角色仍是未知。
　　本研究構(gòu)建了LIMK1野生型載體LIMK1-WT及位點(diǎn)失活型突變載體LIMK1-DN和持續(xù)激活

4、型突變載體LIMK1-CA，通過子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、組織免疫熒光染色技術(shù)和熒光顯微鏡拍照技術(shù)，研究并分析了LIMK1在神經(jīng)元遷移過程中發(fā)揮的作用。為了進(jìn)一步研究LIMK1影響神經(jīng)元遷移的潛在機(jī)制，本研究構(gòu)建了Cofilin持續(xù)激活型載體Cofilin-S3A來進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，闡明了在神經(jīng)元遷移過程中LIMK1與Cofilin的關(guān)系。結(jié)果如下:
　　1.成功克隆了LIMK1基因并構(gòu)建了LIMK1野生型超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染

5、3T3細(xì)胞發(fā)現(xiàn)超表達(dá)LIMK1會促進(jìn)細(xì)胞絲狀偽足的形成;運(yùn)用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)超表達(dá)LIMK1野生型載體顯著地抑制神經(jīng)元的遷移，并引起神經(jīng)元突起增加及頂突起分支數(shù)目增加。
　　2.運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)，成功構(gòu)建了LIMK1位點(diǎn)失活型載體LIMK1-DN，我們將LIMK1-DN電轉(zhuǎn)到小鼠大腦左側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)與LIMK1-WT相比，超表達(dá)LIMK1-DN對神經(jīng)元遷移的抑制作用減弱，并使神經(jīng)元長出了兩個(gè)頂突起。
　　3.為了研究LIM

6、K1的磷酸化位點(diǎn)T508在神經(jīng)元遷移中的功能，構(gòu)建了LIMK1-CA持續(xù)激活型載體。子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示LIMK1-CA更加強(qiáng)烈地抑制了神經(jīng)元遷移，并影響了神經(jīng)元形態(tài)，頂突起長度發(fā)牛明顯改變。
　　4.運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了其下游分子Cofilin的非磷酸化載體Cofilin-S3A來研究LIMK1影響神經(jīng)元遷移的機(jī)制，通過共轉(zhuǎn)LIMK1-CA與Cofilin-S3A發(fā)現(xiàn)可以有效地挽救神經(jīng)元的遷移障礙，并且在高倍鏡下觀察其神經(jīng)元形