JNK結(jié)合蛋白1(JIP1)調(diào)節(jié)帕金森氏病多巴胺能神經(jīng)元凋亡和阿爾茨海默病Tau蛋白磷酸化的研究.pdf

1、前言:
　　 神經(jīng)退行性疾病是指隨年齡老化和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行性變性死亡所引起的中樞神經(jīng)功能減退導(dǎo)致的疾病,包括帕金森氏病、阿爾茨海默病、小腦萎縮癥及肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥等。隨著人們生活水平的提高和社會(huì)人口老齡化的加劇,以帕金森氏病和阿爾茨海默病等為代表的神經(jīng)退行性疾病已成為僅次于心血管疾病、惡性腫瘤和中風(fēng)之后的主要致死疾病,給患者和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。
　　 帕金森氏病(Parkinson'sdisease,PD)是一種與年

2、齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,其病理特征為黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡,導(dǎo)致椎體外束運(yùn)動(dòng)功能障礙,臨床癥狀主要包括肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫及運(yùn)動(dòng)遲緩等。PD黑質(zhì)細(xì)胞死亡的原因尚不清楚,普遍認(rèn)為與以下機(jī)制有關(guān):環(huán)境毒素、遺傳因素、基因突變、氧化應(yīng)激、免疫異常、鐵離子聚集以及神經(jīng)興奮性毒性等。阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD),又稱早老性癡呆,是一種發(fā)生于老年人群的以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)退

3、行性疾病,其主要臨床特征是進(jìn)行性記憶喪失、認(rèn)知缺陷及嚴(yán)重的精神障礙,至今尚無有效的治療手段。
　　 PD的確切發(fā)病機(jī)制還不明確,但是許多研究顯示黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡在PD的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用。最近有研究顯示JNK(c-JunN-terminalkinase,c-Jun氨基末端激酶)信號(hào)通路參與了由MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫毗啶)和6-OHDA(6-hydroxydopamine,6-羥基多巴胺

4、)毒性導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)元凋亡過程,給予JNK的特異性抑制劑之后PD的發(fā)病會(huì)受到抑制或減慢。JNK結(jié)合蛋白1(JIP1)是JNK的支架蛋白,能夠與JNK、MLK(mixed-lineage kinase)和MICK7(Mitogcn-activated proton kinase kinase7)結(jié)合形成復(fù)合物,參與調(diào)節(jié)JNK通路激酶活性,研究顯示JIP1是JNK激酶激活所必需。在PD中,JIP1是否會(huì)通過影響JNK活性而調(diào)節(jié)多巴胺能神

5、經(jīng)元凋亡尚未見報(bào)道。
　　 AD的主要病理學(xué)特征是患者大腦皮層細(xì)胞外出現(xiàn)老年斑,神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibilllary tangle,NFT),,伴有神經(jīng)元死亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化等。NFT是由大量異常磷酸化的Tau蛋白聚集而成。JIP1與磷酸化Tau蛋白(p-Tau)形成病理性結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)抑制了JIP1與kinesin1之間的結(jié)合,從而影響kinesin1介導(dǎo)的正常生理狀態(tài)下的軸突運(yùn)輸。雖然以上研究結(jié)果提示JI

6、Pl通過蛋白結(jié)合作用介入了軸突發(fā)育和軸突運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié),但JIP1對(duì)Tau蛋白磷酸化的影響機(jī)制尚有待于深入研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 采用C57BL/6小鼠和JIP1基因敲除小鼠腹腔注射MPTP制備的PD小鼠模型為研究對(duì)象,應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和牽引實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD小鼠的行為學(xué)變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及Westernblotting技術(shù)檢測(cè)JIP1對(duì)PD小鼠的神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制。采用MTT方法檢測(cè)岡田酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用以確定岡

7、田酸的應(yīng)用濃度,應(yīng)用Westernblotting和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)JIP1對(duì)Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、JIP1基因敲除小鼠的鑒定
　　 從鼠尾提取DNA,利用PCR的方法鑒定JIP1基因敲除小鼠的基因型。
　　 2、JIP1基因敲除對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)的影響
　　 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在野生型小鼠中,與正常對(duì)照組小鼠相比,MPTP模型組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分(即爬

8、格數(shù)和直立數(shù))顯著降低。牽引實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MPTP模型組小鼠評(píng)分顯著低于正常對(duì)照小鼠;而在基因敲除小鼠中,MPTP模型組與對(duì)照組小鼠的牽引評(píng)分無顯著差異。這些結(jié)果表明JIP1基因敲除能夠明顯抑制MPTP誘導(dǎo)的PD行為學(xué)變化。
　　 3、JIP1基因敲除對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響
　　 免疫組織化學(xué)染色(IHC)結(jié)果顯示:在野生型小鼠中,MPTP模型組小鼠黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維較對(duì)照組小鼠顯著減

9、少,而在JIP1基因敲除小鼠中,MPTP模型組小鼠的黑質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的數(shù)量減少程度得到緩解。
　　 光密度分析結(jié)果顯示:野生小鼠中,MPTP模型組小鼠黑質(zhì)的TH(酪氨酸羥化酶)陽性細(xì)胞減少55%,紋狀體的DAT(多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體)免疫陽性產(chǎn)物的光密度值(反應(yīng)多巴胺能神經(jīng)纖維數(shù)量)減少81%,而在JIP1基因敲除組小鼠中,上述指標(biāo)分別減少了25%和61%,較野生小鼠造模組有顯著緩解。
　　 4、JIP1基因敲除對(duì)M

10、PTP誘導(dǎo)的JNK、caspase-3活性的影響
　　 Westernblotting結(jié)果顯示:MPTP顯著增高小鼠中腦內(nèi)JNK1和JNK2的磷酸化水平和caspase-3水平;而在JIP1基因敲除小鼠中,MPTP誘發(fā)的JNK1/2磷酸化和caspase-3水平的增高受到顯著抑制。
　　 5、JIP1對(duì)Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)
　　 Westernblotting結(jié)果顯示:在SH-SY5Y細(xì)胞系中,過表達(dá)JIP1蛋

11、白可上調(diào)Tau231磷酸化水平。
　　 6、JIP1的PTB結(jié)構(gòu)域?qū)au蛋白的磷酸化具有調(diào)節(jié)作用
　　 免疫熒光結(jié)果顯示:缺失PTB結(jié)構(gòu)域的各個(gè)JIP1截短蛋白顯著降低Tau蛋白Ser396位點(diǎn)的磷酸化水平,顯示JIP1的PTB結(jié)構(gòu)域參與Tau蛋白磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 1、JIP1基因敲除明顯緩解PD模型小鼠的行為學(xué)異常,同時(shí)抑制黑質(zhì)、紋狀體多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)纖維數(shù)目的減少。
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