缺氧對LIMK1介導的cofilin磷酸化的影響及其在腸上皮屏障功能損害中的作用研究.pdf

1、目的：
　　腸上皮屏障功能損害及通透性增加是嚴重燒傷早期極其重要的病理生理變化，但其分子機制至今仍未完全清楚。既往的研究表明，腸上皮細胞間的緊密連接(tightjunction，TJ)通過其相關蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與細胞骨架肌動蛋白(actin)相連形成信號互通，在維持腸上皮屏障功能完整性中發(fā)揮著重要作用。在相關信號刺激下，細胞骨架蛋白活動引起細胞回縮，緊密連接蛋白功能失調(diào)，細胞間TJ受損，細胞間隙形

2、成，導致通透性增加。因此，腸上皮細胞TJ蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與骨架肌動蛋白相互作用可能在燒傷后腸上皮屏障功能損害的發(fā)生中具有重要作用。
　　絲切蛋白(cofilin)是一種肌動蛋白結合蛋白，在肌動蛋白的聚合與解聚調(diào)控中具有關鍵作用。Cofilin活化能引起肌動蛋白解聚增加，從而調(diào)控F-肌動蛋白(F-actin)與G-肌動蛋白(G-actin)的動態(tài)平衡。同時，Cofilin活性又受到上游分子LIM激酶

3、(LIMK)的調(diào)控，LIMK是一類具有絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸雙重活性的激酶，能使其底物分子cofilin的Ser3位點發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控cofilin活性。
　　因此，假設嚴重燒傷早期受氧自由基增加、ATP減少、細胞內(nèi)Ca2+變化等諸多影響因素，有可能通過對LIMK的調(diào)控，引起腸上皮細胞cofilin活性變化，肌動蛋白動態(tài)平衡失調(diào)，影響TJ結構，導致腸上皮屏障功能損害及通透性增加。據(jù)此，本課題擬通過體外實驗，建立腸上皮細胞單層模

4、型，研究LIMK/cofilin/F-actin通路在缺氧條件下腸上皮屏障功能損害及通透性變化中的作用，以進一步闡明嚴重燒傷早期缺血缺氧時腸上皮屏障功能損害的分子機制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人腸上皮細胞株Caco-2，將Caco-2細胞種植于Transwell建立腸上皮細胞單層模型。細胞分為正常對照組(缺氧0h)、缺氧1、2、6、12和24h組，細胞缺氧是在1％ O2條件下進行。
　　2.采用生物電阻測定儀檢測跨上

5、皮細胞電阻(TER)，以反映腸上皮細胞單層的屏障功能完整性;用異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran)示蹤法檢測腸上皮細胞單層通透性的變化。
　　3.用間接免疫熒光法分別檢測細胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1分布的變化，Western blot法分別檢測細胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1蛋白表達的變化。
　　4.采用熒光法分別檢測細胞F-actin的分布和F-ac

6、tin/G-actin含量比值的變化。
　　5.采用Western blot法分別檢測cofilin、p-cofilin、LIMK1及p-LIMK1蛋白表達的變化。
　　結果：
　　1.缺氧引起腸上皮細胞單層TER明顯下降，通透性顯著增加，以缺氧6h變化最明顯。
　　2.缺氧對腸上皮細胞單層TJ蛋白Occludin及Claudin-1蛋白表達無明顯影響，但引起ZO-1的蛋白表達降低，并引起ZO-1、Occludi

7、n及Claudin-1分布明顯改變。
　　3.缺氧后腸上皮細胞單層F-actin形態(tài)分布明顯改變，細胞回縮，F(xiàn)-actin/G-actin含量比值明顯降低。
　　4.缺氧后腸上皮細胞單層cofilin蛋白表達無明顯變化，但p-cofilin蛋白表達顯著降低，cofilin磷酸化水平明顯下降。
　　5.缺氧對腸上皮細胞單層LIMK1蛋白表達無明顯影響，但引起p-LIMK1蛋白表達顯著降低，LIMK1磷酸化水平明顯下降。<