PTHrP-,1-34-對(duì)小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的:多種癌癥可以發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，如乳腺癌、肺癌、腎癌，腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子相互作用共同促進(jìn)了腫瘤骨轉(zhuǎn)移的形成和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞釋放的某些因子促使骨轉(zhuǎn)移及骨破壞的形成，骨破壞后骨微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子趨化腫瘤轉(zhuǎn)移至骨并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，這一惡性循環(huán)中的多種因子甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），核因子кB受體活化因子（RANK）近來(lái)成為研究熱點(diǎn)。其中PTHrP在某些腫瘤組織中過(guò)度

2、表達(dá)，其作為主要的破骨細(xì)胞活性介導(dǎo)因子之一，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和成熟，在癌癥溶骨性骨轉(zhuǎn)移及骨破壞的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。以乳腺癌為例，多數(shù)研究表明PTHrP在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有非常重要的作用。但也有人提出PTHrP在乳腺癌原發(fā)灶中的表達(dá)可以改善預(yù)后，使癌細(xì)胞侵襲性降低，提高患者生存質(zhì)量。本研究主要目的是制備小鼠乳腺癌模型，人為持續(xù)給予大劑量PTHrP1-34，結(jié)合全身X線、疑有病變骨組織的病理切片、離體骨生物力學(xué)試驗(yàn)、股骨灰干重比等

3、指標(biāo)，并測(cè)定骨轉(zhuǎn)換血清生化標(biāo)志物，同時(shí)對(duì)瘤體進(jìn)行觀察與測(cè)量，研究持續(xù)性大劑量PTHrP1-34對(duì)小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及骨代謝的影響，為明確開(kāi)發(fā)抗-PTHrP抗體來(lái)抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移是否有意義奠定基礎(chǔ)。 方法:預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別采用腫瘤細(xì)胞懸濁液注射法和腫瘤組織塊懸濁液注射法制備小鼠乳腺癌模型，且兩組各隨機(jī)選取1只，剝離腫瘤塊做病理切片證實(shí)為乳腺癌，以選取較好的荷瘤鼠造模方法，結(jié)果得出后者為佳。40只4-6周齡BALB/C小鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)

4、1周，按體重編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字法將其隨機(jī)分為三組，1組12只作為正常對(duì)照組（對(duì)照組），2、3組各14只，前肢腋下皮下注射乳腺癌組織塊懸濁液制備小鼠乳腺癌模型，10天后以腫瘤長(zhǎng)徑大于4mm做為造模成功鼠，最后入選的小鼠每組各12只。成模后，2組每日予以生理鹽水腹腔注射（模型組），3組每日予以PTHrP1-34400μg/kg腹腔注射（實(shí)驗(yàn)組）。實(shí)驗(yàn)期間，每周固定時(shí)間測(cè)小鼠體重，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，持續(xù)40d后摘眼球取血處死，測(cè)定血清中反映骨

5、轉(zhuǎn)換的生化指標(biāo)水平，包括鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（BGP）、Ⅰ型膠原C-末端交聯(lián)頂端肽β（β-CTX）、骨唾液酸蛋白（BSP），處死前行全身骨X線掃描，觀察骨破壞情況，定位疑有病變部位，測(cè)全身BMD（DEXA法），剝離腫瘤測(cè)其大小與重量，留取腰椎、股骨、脛骨等標(biāo)本，用萬(wàn)能材料分析儀行腰椎（L5）壓縮試驗(yàn)及股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)并行骨礦含量測(cè)定，疑有病變的脛骨制備脫鈣骨石蠟切片、HE染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察。所有數(shù)據(jù)均以均

6、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量樣本均數(shù)組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用四格表資料確切概率法，P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、荷瘤小鼠成模情況：預(yù)試驗(yàn)中分別采用腫瘤細(xì)胞懸濁液注射法和腫瘤組織塊懸濁液注射法制備小鼠乳腺癌模型，前者造模成功率87．5％，且成瘤時(shí)間不一，大小不均；后者可以形成成瘤時(shí)間、大小一致的荷瘤鼠，且成瘤率100％，本實(shí)驗(yàn)中

7、采取腫瘤組織塊懸濁液注射法造模。 2、骨X線、局部解剖學(xué)及脫鈣骨石蠟切片觀察：模型組與對(duì)照組相比較，除1只外其余均未見(jiàn)明顯骨破壞現(xiàn)象，而實(shí)驗(yàn)組有6只存有明顯的溶骨性骨破壞現(xiàn)象，以脛骨近端為明顯，其中1只左后肢脛骨骨折。率的比較用四格表資料確切概率法得出兩組荷瘤小鼠骨破壞發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。取骨病理切片顯示為轉(zhuǎn)移瘤。 3、BMD與股骨灰干重比的比較：對(duì)照組、模型組與實(shí)驗(yàn)組BMD、股骨灰干重比分別為62．

8、43±2．22（g/c㎡）、0．590±0．286，61．88±2．02（g/c㎡）、0．579±0．195，54．83±1．93（g/c㎡）、0．552±0．270，與對(duì)照組和模型組相比，實(shí)驗(yàn)組BMD及股骨灰干重比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01），與對(duì)照組相比，模型組BMD及股骨灰干重比有降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 4、骨生物力學(xué)特性：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠股骨最大載荷降低了12．37％、彈性載荷

9、降低了11．72％、截面慣性矩降低了19．4％、彈性模量降低了26．16％、腰椎最大載荷降低了34．71％；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠股骨最大載荷降低了13．12％、彈性載荷降低了15．61％、截面慣性矩降低了17．24％、彈性模量降低了15．47％、腰椎最大載荷降低了32％。與對(duì)照組和模型組比較，實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05或P<0．01），對(duì)照組與模型組間無(wú)顯著性差異。 5、血清中Ca、P、ALP、β-C

10、TX、BSP、BGP等骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)記物水平：三組小鼠間血清Ca水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組P、BSP、β-CTX等反映骨吸收的指標(biāo)分別升高了31．5％、31．58％、81．25％，血清總ALP、BGP等反映骨形成的指標(biāo)分別降低了19．57％、17．43％；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組P、BSP、β-CTX分別升高了21．92％、14．93％、58．82％，ALP、BGP分別降低了12．48％、11．54％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

11、0．05或P<0．01）。與對(duì)照組相比，模型組血清P、BSP（P=0．064）有升高趨勢(shì)，ALP、BGP有降低趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 6、荷瘤小鼠腫瘤大小及重量比較：模型組腫瘤質(zhì)量0．859±0．176（g），體積297．07±106．70（cm3），實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量1．123±0．192（g），體積824．18±189．79（cm3）。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)快、質(zhì)量、體積大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．

12、01）。 7、三組小鼠體重的變化：與對(duì)照組比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增長(zhǎng)明顯緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組、模型組與實(shí)驗(yàn)組體重增長(zhǎng)總量分別為6．15±1．00（g）、4．64±1．31（g）、3．73±0．87（g），后兩者均顯著低于對(duì)照組（P<0．01），而模型組與實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論: 1、小鼠乳腺癌細(xì)胞MA-782可以在BALB/c小鼠身上成功建立乳腺癌模型，其中腫瘤組織塊懸濁液法可

13、以形成成瘤時(shí)間、大小一致的荷瘤鼠，是研究人類乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各種機(jī)制較理想的動(dòng)物模型。 2、Ca、P、ALP、β-CTX、BSP、BGP等血清生化指標(biāo)、骨生物力學(xué)、全身骨X線掃描，都可以用于輔助判斷腫瘤骨轉(zhuǎn)移及溶骨性骨破壞，其中對(duì)乳腺癌患者的研究表明，血清BSP增加可以提示早期骨轉(zhuǎn)移，骨組織病理切片可以確診腫瘤骨轉(zhuǎn)移。由于小鼠BMD較小，其比較意義并不大。 3、荷瘤小鼠在PTHrP1-34作用下形成骨轉(zhuǎn)移性后，可

14、能是骨破壞后釋放的一系列細(xì)胞因子通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，使得實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積與質(zhì)量較大，同時(shí)PTHrP可能具有直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。另外，荷瘤小鼠的病理狀態(tài)影響了其生長(zhǎng)發(fā)育，使得體重增長(zhǎng)緩慢。 4、長(zhǎng)期給與大劑量PTHrP1-34后，荷瘤小鼠血清P、BSP、β-CTX等反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)的指標(biāo)升高，ALP、BGP等反映成骨狀況的指標(biāo)降低，且骨礦含量、骨生物力學(xué)特性、骨強(qiáng)度均降低，BSP的顯著升高以及病理切片證實(shí)了