骨靶向膠束的制備及其對(duì)骨轉(zhuǎn)移癌的治療作用研究.pdf

1、研究背景：
　　骨腫瘤是一種發(fā)生于骨組織或者其附屬組織的一種常見病，研究發(fā)現(xiàn)至少50％的癌癥晚期患者會(huì)出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞在骨組織中形成骨轉(zhuǎn)移時(shí)，會(huì)對(duì)骨質(zhì)造成破壞。骨的破壞會(huì)產(chǎn)生骨相關(guān)事件（SREs），包括病理性骨折、高鈣血癥、骨髓功能的下降等。這些并發(fā)癥影響了對(duì)腫瘤的治療，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨質(zhì)硬度大、血管分布少、藥物滲透性低等特點(diǎn)，按傳統(tǒng)給藥方式很難將藥物有效遞送至骨轉(zhuǎn)移瘤處。如何有效遞送藥物，是

2、解決骨轉(zhuǎn)移瘤治療難題的關(guān)鍵。
　　雙膦酸鹽類（BPs）對(duì)骨的羥基磷灰石（HA）具有很高的親和力。一旦 BPs進(jìn)入體內(nèi)后，BPs就會(huì)被快速從血液循環(huán)中清除而吸附到暴露的骨礦物質(zhì)區(qū)域。阿侖膦酸鈉（ALN）屬于第三代 BPs類藥物，具有很強(qiáng)的親骨性，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可化學(xué)修飾，被廣泛用作遞藥系統(tǒng)中的骨靶向配體。研究表明，對(duì)環(huán)境響應(yīng)的遞藥系統(tǒng)對(duì)藥物的可控釋放起到關(guān)鍵作用。腙鍵是一種對(duì)pH敏感的化學(xué)鍵，在血液循環(huán)（pH=7.4）中穩(wěn)定，在腫瘤細(xì)

3、胞溶酶體（pH<6）中會(huì)發(fā)生斷裂。通過腙鍵將嵌段共聚物連接可制備出對(duì)pH敏感的遞藥系統(tǒng)。二硫鍵是一種對(duì)谷胱甘肽（GSH）敏感的化學(xué)鍵，腫瘤細(xì)胞內(nèi)外GSH的含量差別巨大。腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度可達(dá)到2-10 mM，而腫瘤細(xì)胞外GSH的濃度約為2-20μM，濃度幾乎相差1000倍。利用二硫鍵連接的遞藥系統(tǒng)可以選擇性的將藥物釋放在GSH含量高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而在血液中可以穩(wěn)定存在。
　　聚乙二醇（PEG）是一種水溶性、生物相容性良好且無免

4、疫原性的非離子聚合物，在藥物遞送系統(tǒng)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。利用PEG上的可修飾基團(tuán)，將其作為靶向配體分子與藥物（或者藥物載體）之間的橋連臂，可構(gòu)建主動(dòng)靶向藥物載體。多糖是一類天然來源的可生物降解的聚合物材料，多糖骨架上的功能基團(tuán)，尤其是羥基，具有顯著增溶作用。
　　目的：
　　本研究以阿侖膦酸鈉為骨靶向配體，以阿霉素（DOX）為模型藥物，分別制備基于聚乙二醇（PEG）的pH敏感膠束和基于葡聚糖（DEX）的氧化還原敏感膠束。觀察

5、其體內(nèi)外抗腫瘤活性及骨靶向性，為骨轉(zhuǎn)移瘤的靶向治療探索新的技術(shù)手段。
　　方法：
　　1．分別制備了pH敏感膠束 DOX-hyd-PEG-ALN和氧化還原敏感膠束OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN。
　　2．通過改變蒸餾水

6、用量、溫度、投藥量等篩選出載藥膠束的最優(yōu)制備工藝。
　　3．通過測(cè)定載藥量、包封率、粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性等對(duì)膠束進(jìn)行表征。
　　4．測(cè)定載藥膠束在不同介質(zhì)溶液中的釋藥特性。
　　5．測(cè)定載藥膠束對(duì)HA的吸附性。
　　6．通過 MTT法測(cè)定載藥膠束的細(xì)胞毒性；利用熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)載藥膠束的攝??；通過激光共聚焦觀察載藥膠束轉(zhuǎn)運(yùn)DOX在腫瘤細(xì)胞中的分布；選用Caspase-3試劑盒測(cè)定載藥膠

7、束對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察載藥膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。
　　7．采用直接注射法制備肺癌骨轉(zhuǎn)移瘤模型；通過 Micro-CT技術(shù)觀察骨轉(zhuǎn)移瘤對(duì)骨的影響；利用活體成像儀和熒光顯微鏡等手段測(cè)定載藥膠束給藥后DOX在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布；通過測(cè)定裸鼠腫瘤體積以及生存率等評(píng)價(jià)載藥膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性；通過組織HE染色法觀察載藥膠束的毒副作用。
　　結(jié)果：
　　一、基于PEG的pH敏感膠束DOX-hyd-PEG

8、-ALN
　　1．通過1H NMR和IR等方法證實(shí)合成的DOX-hyd-PEG-ALN為目標(biāo)物聚合物材料。
　　2．采用透析法制備DOX@DOX-hyd-PEG-ALN，制備溫度為60 oC，制備用水量為32 mL，DOX-hyd-PEG-ALN與DOX的投料比為10:2。最終制得的DOX@DOX-hyd-PEG-ALN粒徑為114 nm，載藥量為24.3%，包封率為64.3%，CMC為2.3 mg/L。TEM觀察顯示DOX

9、@DOX-hyd-PEG-ALN為球形，XPS分析表明骨靶向配體ALN存在于膠束表面。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN體外釋藥具有明顯的 pH依賴性。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對(duì)HA呈現(xiàn)迅速吸附的特性。
　　3．MTT結(jié)果顯示在48 h后，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的細(xì)胞毒性明顯強(qiáng)于DOX。熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的攝取具有時(shí)間依賴性。激光共聚

10、焦結(jié)果表明游離DOX與腫瘤細(xì)胞孵育后能迅速分布于細(xì)胞核內(nèi)，而DOX@DOX-hyd-PEG-ALN轉(zhuǎn)運(yùn)DOX首先分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨著DOX@DOX-hyd-PEG-ALN破壞，釋放出 DOX，然后分布在細(xì)胞核內(nèi)。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用具有時(shí)間和濃度依賴性。DOX以及DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能夠時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G2期和S期阻滯。
　　4．Micro-CT結(jié)果顯示

11、腫瘤生長(zhǎng)處骨質(zhì)被破壞，可見溶骨性區(qū)域。腫瘤切面目測(cè)呈魚肉狀，部分腫瘤細(xì)胞突破骨質(zhì)生長(zhǎng)。HE組織染色結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞核仁清楚且大，細(xì)胞呈不規(guī)則狀排列。
　　5．活體成像儀和熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與DOX相比，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN展現(xiàn)出良好的骨靶向性以及對(duì)腫瘤組織更強(qiáng)的滲透性，同時(shí) DOX@DOX-hyd-PEG-ALN降低了DOX在心臟組織的分布。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于DOX治療組，DOX@DOX-hyd-P

12、EG-ALN治療組裸鼠的生存期得到了顯著延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯抑制。Micro-CT結(jié)果顯示，相比于DOX，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能夠提高骨腫瘤處的平均骨質(zhì)密度。HE組織染色結(jié)果說明DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對(duì)荷瘤裸鼠主要臟器沒有毒副作用，但對(duì)腫瘤組織具有明顯的殺傷作用，腫瘤細(xì)胞排列疏散，腫瘤組織出現(xiàn)大片空洞。
　　二、基于DEX的氧化還原敏感膠束
　　1．通過1H NMR和IR等方法證實(shí)合成的

13、OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN為目標(biāo)聚合物材料。
　　2．采用透析法制備載藥膠束，制備溫度為60 oC，制備用水量為32 mL，材料藥物投料比為10:3。其中 DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-A

14、LN、DOX@ODA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的粒徑約為60 nm，而 DOX@DSPE-DEX(70K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(150K)-ALN粒徑約為90 nm。7種載藥膠束的Zeta電位處于-18到-25 mV之間。膠束載藥量均高于17%，包封率均高于70%。膠束穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-A

15、LN、DSPE-DEX(5K)-ALN以及DSPE-DEX(20K)-ALN在含有20%FBS的 PBS溶液中可以穩(wěn)定存在5天以上；而 DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN和ODA-DEX(5K)-ALN在相同條件下穩(wěn)定性較差，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，其粒徑表現(xiàn)出明顯增大的趨勢(shì)。TEM結(jié)果顯示DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN

16、和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的外觀接近球形；XPS分析表明骨靶向配體ALN存在于膠束的表面。體外釋藥研究表明，膠束釋藥具有GSH濃度依賴性。HA吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過ALN修飾的膠束中，70%以上DOX與HA發(fā)生了吸附。
　　3．MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN對(duì)A54

17、9細(xì)胞、PC-3細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞以及MDA-MB-231/ADR細(xì)胞的毒性作用均明顯大于DOX，其中DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN對(duì)A549細(xì)胞、PC-3細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的毒性強(qiáng)于 DOX@OA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN，且對(duì) A549細(xì)胞的毒性作最強(qiáng)。熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A549細(xì)胞對(duì)DOX@MA-D

18、EX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的攝取具有時(shí)間依賴性。相比于 DOX，DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以很好的將DOX遞送至耐DOX乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231/ADR）內(nèi)。激光共聚焦結(jié)果表明 DOX能迅速的分布于 A549細(xì)胞核內(nèi)，但并不能有效進(jìn)入MDA-MB-231/ADR細(xì)胞內(nèi)。DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20

19、K)-ALN均可將 DOX轉(zhuǎn)運(yùn)至 A549以及耐 DOX的 MDA-MB-231/ADR細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。DOX@MA-DEX(5K)-ALN與DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN誘導(dǎo) A549細(xì)胞和MDA-MB-231/ADR細(xì)胞凋亡的作用均具有時(shí)間和濃度依賴性，且凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于DOX。與DOX相比，DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯的作用更強(qiáng)。
　　5．活體成

20、像儀和熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與DOX相比，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN展現(xiàn)出了良好的骨靶向性以及腫瘤組織蓄積性，同時(shí)載藥膠束降低了DOX在心臟組織的分布。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于 DOX治療組，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN治療組裸鼠的生存期得到了顯著延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯抑制。DOX@MA-DEX(5K)-ALN對(duì)荷瘤裸鼠的體重

21、無明顯影響，治療效果優(yōu)于DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN。Micro-CT結(jié)果顯示，相比于DOX，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN能夠明顯提高骨腫瘤處的平均骨質(zhì)密度。HE組織染色結(jié)果顯示DOX@MA-DEX(5K)-ALN對(duì)荷瘤裸鼠主要臟器沒有毒副作用，對(duì)腫瘤組織具有明顯的殺傷作用。
　　結(jié)論：
　　一、DOX@DOX-hyd-PEG-ALN具有較高的載藥量以及包封率

22、。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可以有效的被腫瘤細(xì)胞攝取，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可使DOX更多的蓄積在骨轉(zhuǎn)移瘤處，增強(qiáng)了DOX的抗腫瘤活性，延長(zhǎng)了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間，減輕了腫瘤細(xì)胞對(duì)骨的破壞作用，并降低了DOX的毒副作用。
　　二、基于 DEX的載藥膠束粒徑均小于100 nm。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以有效的被腫瘤細(xì)胞以及耐藥

23、腫瘤細(xì)胞攝?。黄浔菵OX具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN具有很強(qiáng)的骨靶向性，增強(qiáng)了DOX對(duì)腫瘤的殺傷作用，延長(zhǎng)了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間，減弱腫瘤對(duì)骨的侵襲以及對(duì)骨密度的降低作用，降低了DOX的毒副作用。縱向比較DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DOX-hyd-PEG-ALN對(duì)荷瘤裸鼠的治療作用，結(jié)果顯示 DOX@MA-DEX(5K)-ALN可以將更多的 DOX遞