復方雷公藤外敷對Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎大鼠滑膜組織ERK通路表達的影響.pdf

1、目的:
　　通過復方雷公藤外敷對CIA大鼠血清和滑膜組織中白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素1（Ang-1）的表達以及對滑膜組織ERK通路活化的影響，探討復方雷公藤外敷治療類風濕關節(jié)炎濕熱瘀阻證的抗炎、鎮(zhèn)痛與減輕血管翳形成的作用機制。為復方雷公藤外敷劑在臨床治療類風濕關節(jié)炎提供治療方向和科學依據(jù)。
　　方法:
　　將40只健康雌性SD大鼠逐只稱重后按隨機序列

2、法分為4組，復方雷公藤外敷(0.50g生藥/(kg·d))、扶他林外敷組(0.016ml/(kg·d))、模型組、正常組。采用Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎(CIA)大鼠模型，使用Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部皮下注射，在第七天后于相同部位注射等量Ⅱ型膠原乳化劑以加強免疫，建立CIA大鼠模型。首次免疫后第14天開始涂抹外敷藥物，雷公藤外敷組于大鼠雙后肢膝關節(jié)以下部位去毛，每次給予外敷制劑0.50g生藥/(kg·d)，相當于12.5倍人臨床用量，涂于膝

3、關節(jié)上下0.5em范圍及自踝關節(jié)上0.5cm處以下（包括全部足趾），涂抹時間每天上午9:00-10:00，每天1次，連續(xù)涂抹28天。扶他林外敷組每次給予扶他林乳膠劑0.016ml/(kg·d)，相當于12.5倍人臨床用量，給藥方法、時間同雷公藤外敷組。模型對照組、正常對照組不給予特殊藥物處理。在外敷過程中觀察記錄各組大鼠的活動情況及行為改變、體重變化、關節(jié)腫脹度等。外敷結束后，各組大鼠均于腹主動脈取血，將新鮮血液注入離心管，離心后收集血

4、清，留取大鼠膝關節(jié)滑膜組織，留取大鼠后肢踝關節(jié)及肝、腎、卵巢組織。用ELISA法測定各組大鼠血清及滑膜組織白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)的含量水平;Real-time PCR法測定各組大鼠滑膜組織白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)的mRNA表達水平;Western Blot法檢測

5、滑膜組織中細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)通路的活化情況;并進行大鼠后肢踝關節(jié)關節(jié)及肝、腎、卵巢病理檢測。
　　結果:
　　1.關節(jié)腫脹度變化
　　首次免疫后第10天左右起，各組造模大鼠后足開始腫脹，第21天左右腫脹程度達到高峰，之后關節(jié)腫脹程度稍有減輕;模型組大鼠后足關節(jié)較正常組明顯腫脹(P＜0.001)，兩組外敷組大鼠關節(jié)腫脹程度均較模型組減輕。復方雷公藤外敷組大鼠從免疫后2周起后足體積均較模型組同時間降低，差異均有統(tǒng)

6、計學意義(P＜0.05或P＜0.01)
　　2.大鼠關節(jié)病理切片
　　正常組大鼠關節(jié)面光滑，關節(jié)間隙大小正常，關節(jié)囊結構完整，關節(jié)腔兩面滑膜軟骨結構光滑完整，層次分明，關節(jié)腔無炎癥細胞浸潤，無滑膜組織增生，關節(jié)兩端骨組織致密。模型組關節(jié)間隙明顯增寬，被增生的滑膜組織等完全填充，可見大量炎癥細胞浸潤，關節(jié)軟骨及關節(jié)面嚴重破壞，骨實質侵蝕，結構紊亂。扶他林外敷組和雷公藤外敷組關節(jié)病理較模型組明顯改善，兩者中以雷公藤外敷組改善程度

7、更為顯著，可見相對清晰的關節(jié)面、關節(jié)間隙，關節(jié)腔有少量滑膜組織和炎癥細胞浸潤，關節(jié)兩端骨組織結構尚完整，骨實質疏松，存在少量炎癥細胞浸潤。
　　3.大鼠肝臟、腎臟、卵巢病理切片
　　雷公藤外敷組大鼠肝臟、腎臟、卵巢病理與正常組大鼠相比未見明顯異常。
　　4.血清細胞因子表達水平
　　與正常組相比，CIA模型組血清中IL-1β、TNF-α、Ang-1含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，復方雷公藤外敷組大鼠血

8、清中IL-1β、TN F-α、Ang-1含量均降低（P＜0.01或P＜0.001）。而各組大鼠血清中VEGF含量均測不到，可能與CIA大鼠中VEGF主要在滑膜血管中分泌有關，具體原因有待進一步探究。
　　5.滑膜組織細胞因子表達水平
　　CIA模型組滑膜組織中IL-1β、TNF-α、VEGF和Ang-1含量較正常組明顯升高(P＜0.001)。與模型組相比，復方雷公藤外敷組各細胞因子水平均顯著降低（P＜0.01或P＜0.001

9、）。
　　6.滑膜組織細胞因子mRNA的表達水平
　　滑膜組織細胞因子mRNA的表達水平趨勢與滑膜細胞因子含量水平一致，CIA模型組滑膜組織IL-邛、TNF-α、VEGF、Ang-1的mRNA表達均較正常組顯著升高，復方雷公藤外敷組各細胞因子mRNA水平均不同程度降低。（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）
　　7.Western Blot檢測滑膜組織ERK通路蛋白的表達
　　與正常組相比，CIA模型組E

10、RK通路蛋白磷酸化水平明顯升高;兩組外敷組與CIA模型組相比，ERK通路蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低，雷公藤外敷組降低ERK通路蛋白磷酸化水平更為顯著。
　　結論:
　　1.復方雷公藤外敷劑可以減輕CIA大鼠關節(jié)腫脹度，有良好的抑制滑膜組織增殖、減少炎癥細胞的浸潤、延緩骨與軟骨破壞的效果。
　　2.復方雷公藤外敷劑可以降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α、Ang-1的含量，下調滑膜組織中IL-1β、TNF-α、