三七總皂苷聯(lián)合雷公藤多苷對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠心血管損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于慢性、系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病在RA患者中的發(fā)病率、死亡率不斷增高，已成為RA的首要死亡原因。因此探索RA合并心血管損傷的發(fā)病機(jī)理及防治措施已成為RA研究中亟待解決的重要問題之一。本課題擬在建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過觀察三七總皂苷(PNS)聯(lián)合雷公藤多苷(TG)對CIA大鼠模型外周血炎性細(xì)胞因子及心

2、血管損傷相關(guān)因子，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-Ⅰ)、纖溶酶原激活物抑制劑(Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor, VE

3、GF)水平，以及胸主動(dòng)脈及心肌組織對MCP-1、VEGF表達(dá)的影響，探討中藥有效成分配伍對CIA大鼠心血管損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　選擇體重180-200g的Wistar大鼠，雌雄各半。電子天平稱重，測量雙側(cè)足爪容積后，隨機(jī)分為正常對照組和實(shí)驗(yàn)組（CIA造模組）。實(shí)驗(yàn)組大鼠于尾根部、右足跖及背部常規(guī)消毒后，皮內(nèi)注射雞Ⅱ型膠原共0.2ml/只，第14天實(shí)驗(yàn)組加強(qiáng)免疫一次，建立CIA模

4、型。正常對照組用上述方法注入等量生理鹽水。造模后第21天測量成模大鼠體重、雙后足爪容積，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷組(TG)、TG+PNS、來氟米特組(LEF)，每組6只。正常對照組和模型組用生理鹽水灌胃，其他組分別給予TG(10mg/kg)、TG+ PNS(10mg/kg+200mg/kg)、LEF(10mg/kg)灌胃治療，共42d。灌胃第28d及第42d分別測量各組大鼠體重、雙后足爪容積及關(guān)節(jié)炎指

5、數(shù)，灌胃結(jié)束后第2天，用10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，留取血清。應(yīng)用液相蛋白芯片技術(shù)檢測TNF-α、IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF含量。取血后立即打開胸腔，取出胸主動(dòng)脈及心肌組織，分離周圍脂肪及結(jié)締組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、HE染色，免疫組織化學(xué)法檢測胸主動(dòng)脈及心肌組織MCP-1、VEGF的表達(dá)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS for windows13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均

6、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1實(shí)驗(yàn)大鼠體重變化
　　造模前各組體重統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異(P＞0.05)。造模后第21天，模型組、LEF組、TG組與TG+PNS組體重及體重增加值明顯低于空白對照組(P＜0.01);但模型組、LEF組、TG組與TG+PNS組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。灌胃4周后，模型組、LEF

7、組、TG組與TG+PNS組體重明顯低于空白對照組(P＜0.01);模型組、LEF組、TG組與TG+PNS組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但TG+PNS組體重增加值最大，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。灌胃6周后，模型組、LEF組、TG組與TG+PNS組體重明顯低于空白對照組（P＜0.01）;模型組、LEF組、TG組與TG+PNS組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但TG+PNS組體重增加值最大，明顯高于模型組（P＜0.01）、

8、高于LEF組(P＜0.05)。
　　2各組大鼠雙側(cè)足爪腫脹率及抑制率的變化
　　給藥4周后，LEF組、TG組與TG+PNS組造模側(cè)（右）足爪平均腫脹率明顯低于模型組(P＜0.01);LEF組、TG組與TG+PNS組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但TG+PNS組對造模側(cè)腫脹足爪的抑制率稍優(yōu)于LEF及TG組(37.35％、30.16％、27.58％)。LEF組、TG組與TG+PNS組非造模側(cè)平均腫脹率明顯低于模型組(P＜0

9、.01);LEF組、TG組與TG+PNS組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。給藥后6周LEF組、TG組與TG+PNS組造模側(cè)（右）足爪平均腫脹率明顯低于模型組(P＜0.01);TG+PNS組腫脹率低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TG+PNS組與LEF組相比雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但TG+PNS組抑制率優(yōu)于LEF組(52.89％ VS46.65％)。LEF組、TG組與TG+PNS組非造模側(cè)足爪平均腫脹率明顯低于模型組(P＜0.01

10、);TG+PNS組腫脹率低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TG+PNS組與LEF組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TG+PNS組抑制率略優(yōu)于LEF組(51.60％ VS44.10％)。
　　3各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)的變化
　　造模后第21天，模型組、TG組、LEF組、TG+PNS組之間的AI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;灌胃4周后，與模型組相比，TG組、LEF組、TG+PNS組AI差異顯著(P＜0.01)，其中T

11、G+PNS組AI最低，但與TG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。灌胃6周后，與模型組相比，TG組、LEF組、TG+PNS組AI差異顯著(P＜0.01)，其中TG+PNS組平均AI最低。
　　4各組大鼠血清TNF-α、 IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF水平比較
　　各組TNF-α血清水平(pg/ml)比較結(jié)果:模型組、LEF組、TG組明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);PNS+TG組高于空白組(P＜0

12、.05);模型組明顯高于LEF組、TG組、PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PNS+TG組與LEF組、TG組相比水平最低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　各組IL-6血清水平(pg/ml)比較結(jié)果:模型組、LEF組、TG組明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);PNS+TG組高于空白組(P＜0.05);模型組明顯高于LEF組、TG組、PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PNS+TG組

13、與LEF組、TG組相比水平最低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　各組MCP-1血清水平(pg/ml)比較結(jié)果:模型組、LEF組、TG組明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01); PNS+TG組高于空白組(P＜0.05);模型組明顯高于LEF組、TG組、PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); PNS+TG組與LEF組、TG組相比水平最低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　各組PAI-1血清水平(pg/

14、ml)比較結(jié)果:模型組、LEF組、TG組明顯高于空白對照組(P＜0.01); PNS+TG組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組明顯高于LEF組、TG組、PNS+TG組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;PNS+TG組與LEF組、TG組相比水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　各組VEGF血清水平(pg/ml)比較結(jié)果:模型組、LEF組、TG組明顯高于空白對照組(P＜0.01); PNS+TG組高于空白組，

15、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;模型組明顯高于LEF組、TG組、PNS+TG組（P＜0.01）;PNS+TG組與LEF組、TG組相比水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5各組大鼠胸主動(dòng)脈、心肌病理變化和MCP-1、VEGF的表達(dá)
　　5.1各組大鼠胸主動(dòng)脈及心肌病理變化
　　大鼠胸主動(dòng)脈病理變化:模型組胸主動(dòng)脈的內(nèi)膜完整性差，可見泡沫細(xì)胞的形成，出現(xiàn)脂滴沉積，部分內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞之間的連接被細(xì)胞外脂滴破壞

16、，屬于動(dòng)脈粥樣硬化Ⅲ型改變;在LEF組、TG組中可見部分單核細(xì)胞增多、聚集，內(nèi)膜內(nèi)輕度脂質(zhì)沉積，屬于動(dòng)脈粥樣硬化Ⅰ型改變;PNS+TG組和空白對照組內(nèi)皮顯示完整，連續(xù)性相對較好，未見明顯病理改變。大鼠心肌病理變化:模型組可見心肌廣泛的炎性病變，部分心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，心肌細(xì)胞間可見散在的淋巴細(xì)胞，心肌細(xì)胞內(nèi)有局限性空泡變性;LEF組、TG組病變減輕，部分心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)輕度水腫，局部炎性細(xì)胞聚集，并可見部分心肌細(xì)胞排列紊亂;PNS+TG

17、組治療效果最優(yōu)，僅可見零星炎性細(xì)胞，空白對照組的心肌結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞未見明顯異常變化。
　　5.2各組大鼠胸主動(dòng)脈及心肌VEGF、MCP-1表達(dá)
　　胸主動(dòng)脈中各組VEGF表達(dá)（以灰度值表示）:模型組、LEF組、TG組明顯低于空白對照組（P＜0.01）;PNS+TG組低于空白組(P＜0.05);模型組明顯低于LEF組、TG組、PNS+TG組，呈顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01); LEF組、TG組明顯低于PNS+TG組，

18、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　胸主動(dòng)脈中各組MCP-1表達(dá)（以灰度值表示）:模型組、LEF組、TG組明顯低于空白對照組(P＜0.01);PNS+TG組低于空白組(P＜0.05)，模型組明顯低于LEF組、TG組、PNS+TG組，呈顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01); LEF組、TG組明顯低于PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　心肌中各組VEGF表達(dá)（以灰度值表示）:模型組、LEF組、TG組明顯低于空

19、白對照組(P＜0.01); PNS+TG組低于空白組(P＜0.05);模型組明顯低于LEF組、TG組、PNS+TG組，呈顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);LEF組、TG組明顯低于PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　心肌中各組MCP-1表達(dá)（以灰度值表示）:模型組、LEF組、TG組明顯低于空白對照組(P＜0.01); PNS+TG組低于空白組(P＜0.05);模型組明顯低于LEF組、TG組、PNS+TG組，呈顯著

20、性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);LEF組、TG組明顯低于PNS+TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF血清水平明顯升高，光鏡下主動(dòng)脈內(nèi)膜可見脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞形成，心肌組織可見炎癥細(xì)胞浸潤，主動(dòng)脈及心肌MCP-1、VEGF表達(dá)增強(qiáng)，證實(shí)CIA大鼠存在心血管損傷的相關(guān)因素。
　　2、三七總皂苷聯(lián)合雷公藤多苷明顯降低CIA大鼠足