2型糖尿病股骨骨折后骨硬化蛋白及WNT信號通路相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　高血糖導(dǎo)致的骨折不愈合主要原因是在骨折修復(fù)的過程中，高血糖促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞分化，減少成骨和軟骨內(nèi)骨化。以往對骨鈣素、1型膠原氨基端肽(PINP)和Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的研究主要是針對于糖尿病骨質(zhì)疏松的研究，尚未有骨硬化蛋白及上述指標(biāo)在2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus，T2DM)股骨骨折愈合中相關(guān)變化規(guī)律的報道。有發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞

2、分化，及抑制成骨細(xì)胞凋亡方面起到積極的作用，但Wnt信號對于T2DM患者骨折修復(fù)是否發(fā)揮作用及其作用機制尚未見相關(guān)報道。
　　研究目的：
　　1、股骨骨折合并T2DM患者相對于未合并T2DM患者在骨折愈合在急診入院時血液骨代謝指標(biāo)（骨硬化蛋白、骨鈣素、PINP和β-CTX）的變化情況檢測，通過對結(jié)果的分析比較，以確定候選主要參與骨折修復(fù)重建的關(guān)鍵因子。
　　2、從細(xì)胞水平驗證骨硬化蛋白對成骨細(xì)胞hFOB1.19干擾后引

3、起的成骨功能變化的規(guī)律，以確定骨硬化蛋白是否具有調(diào)節(jié)其余三個骨代謝標(biāo)志物的作用。
　　3、通過Wnt激動劑和骨硬化蛋白處理hFOB1.19，來檢測骨硬化蛋白是否通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路上的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）來調(diào)節(jié)骨重建的。
　　4、沉默hFOB1.19細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，檢測骨代謝指標(biāo)骨鈣素、PINP和β-CTX的變化規(guī)律，進(jìn)一步揭示骨重建可能的調(diào)節(jié)機制，為研制治療糖尿病導(dǎo)致的骨不愈合的藥物提供新的藥

4、物治療靶點。
　　方法：
　　隨機選取2014年6月到2015年6月在呼和浩特市第一醫(yī)院骨科就診的股骨骨折伴有T2DM患者32例作為實驗組，同期在該時間段內(nèi)股骨骨折未合并有糖尿病的患者27例作為對照組，全部患者在急診入院時分別抽取靜脈血液樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測量骨折修復(fù)重建過程中骨鈣素、PINP、β-CTX和骨硬化蛋白的含量變化。對hFOB1.19細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細(xì)胞后，采用qR

5、T-PCR檢測骨鈣素、PINP、β-CTX的mRNA表達(dá)量。Wnt激動劑和骨硬化蛋白處理hFOB1.19細(xì)胞，采用免疫印跡(Western blot)法檢測β-catenin和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)含量變化。利用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染siRNA-β-catenin到hFOB1.19細(xì)胞中，Western blot檢測β-catenin蛋白含量變化和qRT-PCR檢測骨鈣素、PINP、β-CTX的mR

6、NA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　在股骨骨折急診入院患者血清中，T2DM骨硬化蛋白的含量相對于對照組顯著增高，骨鈣素、PINP和β-CTX的含量顯著降低，且骨硬化蛋白與骨鈣素、PINP、β-CTX含量之間為線性負(fù)相關(guān)。骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細(xì)胞后，骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA水平均隨著骨硬化蛋白的濃度增高而逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)。Wnt激活劑和骨硬化蛋白干擾hFOB1.19細(xì)胞后，胞質(zhì)中的β-catenin蛋白

7、表達(dá)量無顯著性差異，而Wnt激活劑可以下調(diào)細(xì)胞質(zhì)中p-β-catenin的水平，骨硬化蛋白可以上調(diào)p-β-eatenin的水平，而且骨硬化蛋白濃度越大p-β-catenin上調(diào)的水平越高。siRNA-β-catenin轉(zhuǎn)染后成功干擾hFOB1.19細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，同時使骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA水平顯著降低。
　　結(jié)論
　　1、在股骨骨折早期愈合過程中，T2DM骨硬化蛋白的含量相對于對照組顯著增高，

8、骨鈣素、PINP和β-CTX的含量顯著降低，推測骨硬化蛋白可能參與T2DM骨折愈合過程。
　　2、骨硬化蛋白可以下調(diào)骨鈣素、PINP和β-CTX的mRNA表達(dá)水平，影響骨修復(fù)重建的進(jìn)程。
　　3、骨硬化蛋白可以上調(diào)p-β-catenin的水平，而且其濃度越大p-β-catenin上調(diào)的水平越高。推測骨硬化蛋白是通過調(diào)節(jié)p-β-catenin水平，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)骨折修復(fù)重建過程的。
　　4、β-catenin表達(dá)的下降，可