小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的NAMPT對腦缺血慢性期炎癥的調(diào)控作用及其作用機制.pdf

1、研究背景:
　　缺血性腦卒中是一種致殘及致死性均高的疾病。腦缺血所致的損傷不僅來自急性期缺血導(dǎo)致的腦損傷，也來自于后期繼發(fā)的炎癥反應(yīng)造成的腦損傷。目前急性腦缺血的治療藥物僅有溶栓藥，對于腦缺血后期的治療手段十分缺乏。
　　小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)介導(dǎo)炎癥和免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其持續(xù)激活介導(dǎo)腦缺血慢性期的炎癥。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有兩種類型，分別稱為經(jīng)典激活(classicalactivation)的小膠質(zhì)細(xì)胞和選擇性激活(alterna

2、tive activation)的小膠質(zhì)細(xì)胞，一般認(rèn)為，M1型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種炎癥因子會對大腦神經(jīng)功能恢復(fù)將產(chǎn)生有害作用;而M2型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有抗炎作用。因而調(diào)整小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)（極化類型）可能作為抗腦缺血損傷治療的靶點事件。
　　煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NicotinamidePhosporibosyltransferase，NAMPT），又被稱作內(nèi)臟脂肪素(visfatin)和前B細(xì)胞克隆增強因子(Pr

3、e-B-cell colony-enhancingfactor, PBEF)，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）補救合成途徑的限速酶，NAMPT通過NAD及NAD依賴的酶（如Sirtuins、PARPs）在細(xì)胞物質(zhì)能量代謝、衰老、炎癥、免疫等過程中起重要作用。NAMPT在體內(nèi)廣泛存在，并可被外周炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等釋放，而進一步參與外周炎癥過程;NAM

4、PT特異性抑制劑FK866被報道有明顯的抗炎作用。在中樞，NAMPT主要表達(dá)于神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)NAMPT。因而，有關(guān)NAMPT在中樞炎癥中的作用，如其在腦缺血后的炎癥中的作用報道很少。
　　我們實驗室發(fā)現(xiàn)，在老年小鼠腦內(nèi)，NAMPT大量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，而長期慢性的中樞炎癥是老年腦的主要特征之一;另外，我們還發(fā)現(xiàn)，NAMPT在大鼠腦缺血急性期不表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞，但在大鼠腦缺血后期，小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)NAMPT，而星形膠質(zhì)細(xì)胞

5、始終不表達(dá)NAMPT;腦缺血后腦脊液中NAMPT水平升高;我們推測，腦缺血后期小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)NAMPT與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥有關(guān)，而腦缺血后腦脊液中高水平的NAMPT除來自損傷的神經(jīng)元和外周的NAMPT經(jīng)損傷的血腦屏障滲入外，還可能來自小膠質(zhì)細(xì)胞的釋放，這些釋放的NAMPT也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的缺血慢性期炎癥。因而，本課題關(guān)注以下問題:1）小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的NAMPT是否參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦缺血慢性期的炎癥，其涉及的機

6、制有哪些？2）在缺血和炎癥條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞能否釋放NAMPT?小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMPT的具體出胞機制是怎樣的？
　　研究目的:
　　探討在整體腦缺血過程中及離體缺血條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的NAMPT對腦缺血慢性期炎癥的調(diào)控及其作用機制;在缺血和炎癥條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMPT的出胞途徑及其影響因素。
　　研究方法:
　　第一部分:
　　以NAMPT抑制劑FK866側(cè)腦室注射預(yù)給藥，大鼠局灶性腦缺血再灌

7、注處理(MCAO1h/R14d)后，以行為學(xué)檢測反映大鼠神經(jīng)功能損傷/恢復(fù)情況，腦片免疫組化、免疫熒光染色觀察神經(jīng)元存活、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況;以缺糖缺氧再恢復(fù)（OGD1 h/R24 h）處理原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，用免疫熒光染色觀察原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞NAMPT的表達(dá)情況;以FK866預(yù)處理給藥，原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞OGD1 h/R24 h處理后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化;以不同濃度FK866預(yù)處理給藥后，以O(shè)GD1 h/R24 h處理小

8、鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞，觀察BV2小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，檢測小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放;以O(shè)GD1 h/再恢復(fù)0-24 h處理 BV2細(xì)胞后，檢測BV2細(xì)胞內(nèi)M1與M2型標(biāo)記物的表達(dá);以FK866預(yù)處理給藥后，以O(shè)GD1 h/R24 h處理BV2細(xì)胞，檢測BV2細(xì)胞內(nèi)M1與M2型標(biāo)記物的表達(dá);以O(shè)GD1 h/R24 h處理BV2細(xì)胞，檢測胞漿和細(xì)胞核的NF-κB表達(dá)水平;以FK866預(yù)處理，檢測OGD1 h/R24 h處理后胞漿和細(xì)胞核

9、NF-κB表達(dá)水平變化;以NF-κB抑制劑做預(yù)處理，在OGD1 h/R24h處理BV2細(xì)胞后，檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和NAMPT的表達(dá)。
　　第二部分:
　　原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞以O(shè)GD1h/R24h處理后，免疫熒光染色觀察NAMPT細(xì)胞內(nèi)分布和表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞釋放NAMPT，同時檢測細(xì)胞處理后培養(yǎng)基上清LDH活性變化，以及PI染色鑒定細(xì)胞壞死;采用體外模擬缺血條件（OGD/R）以及以炎癥條件(TNF-α)單

10、獨或聯(lián)合應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞釋放刺激因子ATP處理BV2細(xì)胞后，以免疫熒光染色聯(lián)合特定標(biāo)記分子確定法，檢測NAMPT與溶酶體、多種內(nèi)體是否存在共定位;以透射電鏡觀察BV2細(xì)胞的囊泡釋放，并通過囊泡直徑測量初步確定BV2細(xì)胞經(jīng)以上處理后釋放大量外泌體;以免疫電鏡觀察BV2初步確定NAMPT通過外泌體途徑釋放;采用超速離心法或商業(yè)性外泌體提取試劑盒方法收集細(xì)胞上清中的外泌體后，以Western blotting方法檢測外泌體中NAMPT的量;以磷

11、脂酶D抑制劑預(yù)處理后，以O(shè)GD/R聯(lián)合ATP處理BV2細(xì)胞，并提取細(xì)胞上清中的外泌體，以Western blotting檢測外泌體中NAMPT量的釋放量變化。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的NAMPT對腦缺血慢性期炎癥的調(diào)控作用及其作用機制
　　在整體動物實驗中，NAMPT抑制劑FK866(10 nM)側(cè)腦室預(yù)給藥可改善局灶性腦缺血再灌注(MCAO1 h/R14d)所致的大鼠神經(jīng)功能下降，減小腦梗死體積，

12、提高神經(jīng)元存活率，抑制膠質(zhì)疤痕形成，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和增殖;在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞上，離體缺血條件——缺糖缺氧再恢復(fù)（OGD1 h/R24 h）可誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞激活并伴隨NAMPT上調(diào)表達(dá);FK866(1 nM)預(yù)處理可抑制OGD1h/R24 h誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變圓和激活;在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞上，F(xiàn)K866(0.001-1 nM)抑制OGD1 h/R24h誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變圓及TNF-α、NAMPT、IL-6的

13、釋放;FK866可逆轉(zhuǎn)OGD1 h/R0-24 h誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的M1型極化的標(biāo)記分子TNF-α、IL-6的mRNA的表達(dá)上調(diào)和M2型極化的標(biāo)記分子CD206、Arg-1的mRNA的表達(dá)下調(diào)水平;FK866(1 nM)可顯著抑制OGD1h/R24 h誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NF-κB核移位;NF-κB的抑制劑PDTC(50μM)可部分逆轉(zhuǎn)OGD1 h/R24 h誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。
　　第二部分缺血和炎癥條件下小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMP

14、T的出胞途徑及其影響因素
　　OGD/R處理可誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞主動釋放NAMPT;免疫熒光染色結(jié)果表明，NAMPT與溶酶體、自噬體、內(nèi)體無共定位;以O(shè)GD/R或TNFα處理BV2細(xì)胞后，NAMPT在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生移位（向胞膜下分布），而OGD/R或TNFα合并應(yīng)用ATP能使細(xì)胞表面“長出”有大量NAMPT陽性的小囊泡;對以透射電鏡獲取這些囊泡的照片，進行分析，發(fā)現(xiàn)大部分小泡直徑在100 nm左右，與外泌體的大小相符;免疫電鏡結(jié)果可確

15、證BV2細(xì)胞釋放的，這些外泌體很多是NAMPT陽性的;以超速離心收集這些外泌體，并進一步做免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)NAMPT在外泌體中大量表達(dá);這充分說明，BV2細(xì)胞通過外泌體釋放NAMPT;我們還發(fā)現(xiàn)磷脂酶D抑制劑1-butanol能夠抑制NAMPT通過外泌體釋放，說明磷脂酶D參與調(diào)控NAMPT的釋放。
　　結(jié)論:
　　1.腦缺血后期小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)并釋放NAMPT;抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的NAMPT可通過逆轉(zhuǎn)腦缺血誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M