14-3-3蛋白對活化的小膠質細胞表達炎癥相關因子的影響及其作用機制的研究.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分:脂多糖誘導的小膠質細胞激活對14-3-3蛋白表達變化的研究
　　目的:觀察14-3-3蛋白在小膠質細胞中的表達及脂多糖誘導后的表達變化。
　　方法:脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導劑量100ng/ml,以BV-2細胞作為小膠質細胞的體外細胞模型,LPS作用BV-2細胞后,分別收集細胞和細胞上清,用免疫熒光、流式細胞儀、免疫印跡法(Western

2、blot)檢測細胞中14-3-3蛋白的表達,ELISA法測定細胞上清中白細胞介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,酶法測定細胞上清中一氧化氮(NO)的含量。
　　結果:LPS誘導小膠質細胞激活,大量釋放炎性細胞因子IL-1β、TNF-α及NO,與靜息的小膠質細胞相比IL-1β、TNF-α、NO分別在6小時、2小時、12小時達高峰(P<0.01),并持續(xù)至24小時,同時14-3-3蛋白表達水平下降(P<0.0

3、5)。
　　結論:在LPS誘導的小膠質細胞激活中,14-3-3蛋白的表達減少,同時IL-1β、TNF-α及NO的分泌增加。14-3-3蛋白在小膠質細胞的活化過程中發(fā)揮了作用。
　　第二部分:14-3-3蛋白過表達對LPS誘導的BV-2細胞分泌IL-1β、TNF-α、iNOS的影響
　　目的:觀察14-3-3蛋白在小膠質細胞中的過表達對脂多糖誘導的小膠質細胞激活及釋放IL-1β、TNF-α、iNOS的影響。
　　方

4、法:用脂質體2000(Lipofectamine2000)轉染pcDNA3.1(+)14-3-3ε質粒到BV-2細胞中,再用LPS作用于小膠質細胞,設未轉染的細胞為對照組,免疫印跡法(Western blot)檢測轉染效率。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達。ELISA法測定細胞上清中白細胞介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,酶法測定細胞上清中

5、一氧化氮(NO)的含量。
　　結果:pcDNA3.1(+)14-3-3ε質粒轉染組14-3-3蛋白表達明顯高于未轉染組(P<0.01)。14-3-3蛋白過表達的BV-2細胞,LPS的激活作用受到抑制,IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達較未轉染的對照組下降(P<0.05)。細胞上清中 IL-1β、TNF-α、NO分泌減少(P<0.05)。
　　結論:14-3-3蛋白的過表達可以減輕LPS誘導的小膠質

6、細胞的激活,下調IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達,減少IL-1β、TNF-α、NO的釋放。
　　第三部分:BV-2細胞激活的條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y細胞凋亡的影響14-3-3蛋白抑制小膠質細胞激活的NF-κB途徑探討
　　目的:觀察BV-2細胞激活的條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y細胞凋亡的影響。14-3-3蛋白對BV-2細胞核轉錄因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)-D

7、NA活性的影響。
　　方法:以SH-SY5Y細胞作為多巴胺能神經元細胞模型,用LPS激活BV-2細胞和14-3-3蛋白過表達BV-2細胞后的細胞上清作為條件培養(yǎng)液(Microglia conditioned medium, MCM;14-3-3 protein overexpression Microglia conditioned medium, OMCM),處理SH-SY5Y細胞,并設空白對照組,應用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法

8、)檢測SH-SY5Y細胞存活率,磷脂結合蛋白(AnnexinⅤ)-碘化丙啶(PI)雙染色流式細胞儀檢測SH-SY5Y細胞凋亡。應用凝膠電泳遷移率實驗( electrophoretic mobility shift assay, EMSA)測定小膠質細胞中NF-κB-DNA的結合活性。
　　結果:與空白組相比,受MCM處理的SH-SY5Y細胞,存活率明顯下降,細胞凋亡率增加(P<0.01),受OMCM處理的SH-SY5Y細胞,其存活

9、率較MCM組上升,細胞凋亡率下降(P<0.01)。而單獨用LPS作用于SH-SY5Y細胞,其存活率及凋亡率與空白組相比無明顯差別(P>0.05)。LPS誘導BV-2細胞激活后,BV-2細胞的NF-κB-DNA的結合活性明顯提高(P<0.01)。在LPS誘導的14-3-3蛋白過表達BV-2細胞中NF-κB-DNA的結合活性明顯下降(P<0.01)。
　　結論:活化的小膠質細胞釋放致炎性細胞因子對多巴能神經元具有損傷作用。14-3-3