基于半抗原抗體技術研究人參皂苷在腦組織內(nèi)的分布.pdf

1、目的:目前國內(nèi)外大量研究均證明人參的有效成分人參皂苷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有肯定的藥理作用?；谌藚⒌倪@種中樞活性，人參皂苷能否透過血腦屏障(BBB)成為當前的研究熱點。大多數(shù)研究學者們認為人參皂苷不能透過BBB，但也有少數(shù)學者認為人參皂苷可透過BBB?；诋斍暗倪@種研究現(xiàn)狀，本實驗擬采用腦組織勻漿和腦脊液高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)檢測技術和腦組織切片免疫組織化學法(IHC)檢測分析技術，再次回答這個科學問題。且如果不能透過，是否能到

2、達BBB;如果能，可具體分布于BBB的哪些細胞中。通過回答上述科學問題，將有助于探討人參皂苷中樞活性的作用機理，并為研究其中樞作用靶點提供基礎實驗數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　實驗1:高純度人參總皂苷的制備
　　本實驗采用大孔吸附樹脂D101聯(lián)用陰陽離子交換樹脂制備高純度人參總皂苷，并通過香草醛-硫酸比色法和電噴霧檢測器(CAD)柱后流動相補償一測總評法對皂苷的含量進行測定。
　　實驗2:人參皂苷半抗原抗體的制備與純化

3、
　　首先用以上所得高純度人參皂苷偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)，得到人參皂苷半抗原，SDS-PAGE凝膠電泳檢驗是否偶聯(lián)成功;再以偶聯(lián)成功的人參皂苷-BSA免疫兔子，獲得抗血清;然后通過硫酸銨沉淀、蛋白A柱純化、抗原柱純化，得效價較高的抗人參皂苷抗體;最后酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測抗體效價，生物膜層干涉技術測定人參皂苷各單體與抗人參皂苷抗體之間的親和力，免疫細胞化學法進一步檢測抗體的有效性。
　　實驗3:液質(zhì)聯(lián)用(LC-

4、MS)檢測腦組織及腦脊液中的人參皂苷
　　小鼠人參皂苷灌胃1周，取全腦，制備腦組織勻漿，勻漿液固相萃取預處理后，LC-MS檢測人參皂苷。大鼠人參皂苷給藥1周，取腦脊液，LC-MS檢測人參皂苷含量。
　　實驗4:免疫組織化學法(IHC)測定人參皂苷在腦組織內(nèi)的分布
　　首先采用免疫組織化學的方法研究人參皂苷是否能在腦冰凍切片組織中被檢出。然后，采用免疫熒光雙染法，使用星形膠質(zhì)細胞標志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神

5、經(jīng)元神經(jīng)元標志物特異性核蛋白(NEUN)、血管內(nèi)皮細胞標志物血管性假血友病因子(VWF)兩兩聯(lián)用，研究人參皂苷在這些細胞中是否有陽性顯色。
　　結果:
　　實驗1:人參皂苷樣品中含單體皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rg1、Rg2、Rg3、Rc、Rd、Re、Rf、 Rh1、F2、F3，香草醛-硫酸比色法測得總皂苷含量為101.8±2.5％，一測總評法測得總皂苷含量為75％，非皂苷類成分約25％。
　　實驗2:SDS-PAG

6、E凝膠電泳分析人參皂苷-BSA條帶略高于BSA條帶，說明人參皂苷與BSA偶聯(lián)成功;ELISA檢測純化后的抗體效價及特異性都較好;生物膜層干涉技術測得抗人參總皂苷抗體與人參總皂苷、人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rh2、原人參二醇、F1、化合物K、原人參三醇的親和力分別為3.99×10-7、4.69×10-9、2.59×10-9、2.40×10-6、1.62×10-4、2.64×10-7、1.66×10-10、1.08×10-7和1.32×

7、10-6;免疫細胞化學法顯示抗體在人參總皂苷孵育的細胞內(nèi)有強陽性染色。
　　實驗3:LC-MS在腦組織勻漿液中能檢測到人參皂苷Rg1，LC-MS在腦脊液中沒有檢測到人參皂苷。
　　實驗4:IHC在腦組織切片中能檢測到人參皂苷，并能被游離的人參皂苷所阻斷;免疫熒光雙染法在血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞中檢測到人參皂苷，大多數(shù)神經(jīng)元中沒有檢測到人參皂苷，少數(shù)神經(jīng)元中能檢測到人參皂苷。
　　結論:1.人參皂苷能到達BBB，可分布