高活性人參皂苷催化酶的篩選.pdf

1、稀有人參皂苷Compound K(C-K)在抗腫瘤等方面的獨(dú)特效果受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。但是人參皂苷C-K在自然界含量極低，限制了人參皂苷C-K的應(yīng)用需要。為此，利用生物轉(zhuǎn)化法來(lái)制備稀有人參皂苷C-K已成為生物醫(yī)藥研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)以來(lái)自Sulfolobus solfa taricus的β-糖苷酶(LacS)為基礎(chǔ)，篩選高效催化主要人參皂苷Rb1為C-K的β-糖苷酶等的工業(yè)用酶。
　　 首先通過(guò)易錯(cuò)PCR建立突變文庫(kù)，然后給予選擇

2、壓力進(jìn)行定向篩選，最后對(duì)改造后具有優(yōu)良特性的β-糖苷酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的表征。理論上LacS催化1分子Rb1生成C-K會(huì)產(chǎn)生3分子的還原糖。因此通過(guò)DNS法檢測(cè)還原糖的量來(lái)建立高通量的篩選方案，進(jìn)而篩選出高活性人參皂苷催化酶。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到一株能夠高效催化Rb1變成C-K的優(yōu)良菌種。異源表達(dá)的LacS氨基酸的第218位由纈氨酸(Val)變成了甘氨酸(Gly)。由此將LacS催化Rb1的活性提高了2.5倍。突變后的LacS的最適

3、反應(yīng)溫度也由野生型(WT)的85℃下降到70℃。用0.04mg/ml的突變體LacS在McBuffer緩沖液(pH5.5)溶液中，70℃水浴條件下，可以在1h將3.2mg/mlRb1消耗完，97％轉(zhuǎn)化為C-K(mol/mol)，為最終的工業(yè)化生產(chǎn)人參皂苷C-K提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 優(yōu)良的突變體相對(duì)于野生型只有一個(gè)氨基酸的變化，能充分證明LacS的218位點(diǎn)的氨基酸的變化導(dǎo)致了LacS的三維立體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這種改變使LacS