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文檔簡(jiǎn)介
1、一定條件的刺激下,牙髓細(xì)胞可以向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化,骨形態(tài)發(fā)生蛋-2(BMP-2)在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MicroRNAs作為一類(lèi)具有調(diào)控功能的微小RNA,廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞中,這類(lèi)小片段非編碼RNA在基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究的目的旨在篩選出BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞牙向分化的miRNA標(biāo)志物,確定部分差異表達(dá)的miRNA。
目的:
1、體外分離培養(yǎng)和鑒定人牙髓細(xì)胞,建立穩(wěn)定的人牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)。
2、
2、用BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞,并對(duì)誘導(dǎo)后的牙髓細(xì)胞進(jìn)行成牙本質(zhì)鑒定,以探究BMP-2誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的適宜條件。
3、通過(guò)miRNAs芯片篩選出BMP-2誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)分化過(guò)程中,差異表達(dá)的miRNAs,并用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)而豐富miRNAs對(duì)BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的了解。
方法:
1、人牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:收集新鮮拔除、無(wú)牙體及牙周疾病的正畸牙或智齒,無(wú)菌條
3、件下劈開(kāi)牙冠取出牙髓,加入0.25%的胰蛋白酶,邊剪邊消化后,將牙髓組織放入培養(yǎng)瓶中,加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至瓶底80%-90%后,消化傳代細(xì)胞,并行波形絲蛋白和角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色,取穩(wěn)定培養(yǎng)的4-6代牙髓細(xì)胞待用。
2、BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化:用不同濃度的BMP-2(濃度分別為50、100、150ng/ml),誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞,檢測(cè)BMP-
4、2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組和空白組(不含BMP-2的常規(guī)DMEM培養(yǎng)基)細(xì)胞ALP、DMP-1、DSPP基因的表達(dá),從而初步探究BMP-2誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的適宜濃度。
3、BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中miRNAs表達(dá)譜的獲得:將誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞和空白組細(xì)胞送檢生物公司,獲得誘導(dǎo)細(xì)胞miRNAs差異表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)明顯的miRNAs,并用熒光定量PCR驗(yàn)證,預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因和功能,進(jìn)而探究和豐富miRNAs對(duì)
5、牙髓細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的了解。
結(jié)果:
1、人牙髓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:(1)牙髓組織培養(yǎng)3-5天后,可見(jiàn)有牙髓細(xì)胞爬出,形態(tài)多為梭形、纖維狀,胞漿豐富,胞核位于細(xì)胞中央,呈橢圓形。10天左右細(xì)胞生長(zhǎng)融合至瓶底的90%。(2)傳代后的細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng),大小相似,密集排列,鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的極性,6天左右細(xì)胞可以經(jīng)消化進(jìn)行傳代。(3)經(jīng)細(xì)胞免疫化學(xué)染色可見(jiàn),細(xì)胞波形絲蛋白陽(yáng)性表達(dá),角蛋白陰性表達(dá),結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)
6、源于中胚層。
2、BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化:用不同濃度的BMP-2誘導(dǎo)液(BMP-2濃度分別為50ng/ml、100ng/mL、150ng/mL)誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞一定天數(shù)后,牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化,RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)組和空白組細(xì)胞目的基因的表達(dá)量得知,BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的適宜濃度為100ng/ml。
3、BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化miRNAs表達(dá)譜的獲得:將細(xì)胞樣品送檢生物
7、公司,獲得差異的miRNAs表達(dá)譜,可見(jiàn)約52條miRNAs發(fā)生了明顯的改變,其中,上調(diào)23條,下降29條。挑選其中5條(上調(diào)3條,下調(diào)2條),利用熒光定量PCR,驗(yàn)證miRNAs芯片的可信性。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因和功能。
結(jié)論:
1、利用改良酶消化法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞,可以獲得穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。
2、成功探究BMP-2誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的適宜濃度,豐富了BMP-2對(duì)牙髓細(xì)胞作用的認(rèn)識(shí)。
3、
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