模擬心肌微環(huán)境中BMP-2誘導大鼠BM-MSCs向心肌樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:建立心肌細胞與BM-MSCs共培養(yǎng)體系,探討在模擬心肌微環(huán)境中,BMP-2對BM-MSCs向心肌細胞分化的影響。
　　 方法:
　　 (1)大鼠心肌細胞、BM-MSCs分離培養(yǎng)。
　　 (2)用BMP-2誘導BM-MSCs分化,分別建立不同濃度的BMP-2作用組,誘導14天后,經(jīng)RT-PCR方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、GATA4、Mef2c)以及成熟心肌細胞特異性基因(cTnI、

2、ANP、α-MHC、β-MHC)核酸表達,確定BMP-2對BM-MSCs誘導作用的最佳作用濃度。
　　 (3)應用最佳濃度的BMP-2誘導與心肌細胞共培養(yǎng)的BM-MSCs,分為六組:A組:骨髓間充質(zhì)干細胞組;B組:BM-MSCs+心肌細胞+Noggin組:C組:BM-MSCs+心肌細胞組;D組:BM-MSCs+心肌細胞+BMP-2誘導組;E組:BM-MSCs+心肌細胞+Noggin(共培養(yǎng)3天后撤除)+BMP-2誘導組;F組:心

3、肌細胞組。
　　 (4)應用RT-PCR和免疫細胞化學方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌細胞特異性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的核酸表達,分析BMP-2在心肌細胞旁分泌作用下對BM-MSCs向心肌細胞分化的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)細胞培養(yǎng)成功進行心肌細胞、BM-MSCs分離、純化、鑒定及擴增,建立心肌細胞/BM-MSCs共培養(yǎng)的

4、方法體系。
　　 (2)BMP-2誘導BM-MSCs分化的最佳作用濃度與骨髓間充質(zhì)干細胞組相比較,經(jīng)不同濃度BMP-2誘導的BM.MSCs中α-MHC、β-MHC、NKX2.5表達顯著增強;然而,心肌細胞特異性標記GATA4、Mef2c、cTnI、ANP的表達變化不明顯,其差異無統(tǒng)計學意義。不同濃度作用組相比較,0.5組α-MHC、β-MHC、NKX2.5表達顯著增強,組間差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 (3)在心肌微環(huán)境

5、中BMP-2對BM-MSCs向心肌細胞分化的影響RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與A組比較,B組α-MHC、β-MHC、NKX2.5、GATA4、MEF2C、cTnI、ANP表達無明顯變化;C、D和E組的心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異性標記的表達明顯增強,差異有統(tǒng)計學意義;其中E組的各指標表達最強,與其他各組相比,差異有統(tǒng)計學意義。免疫熒光染色結(jié)果顯示,A、B組偶見cTnI+細胞。C、D和E組均見較多cTnI+細胞。統(tǒng)計分析顯示,E組和C組與