骨髓間充質干細胞體外定向分化成軟骨細胞過程中特殊microRNAs表達變化的研究.pdf

1、研究背景： 關節(jié)軟骨損傷退變是骨科臨床上尚未完全解決的難題，老年人以軟骨退變?yōu)橹?，年輕人則以運動創(chuàng)傷引起的軟骨損傷為首要原因，晚期發(fā)展為骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，可引起疼痛和病殘，導致生活質量降低、醫(yī)療費用增加等問題。關節(jié)軟骨自身修復能力十分有限，臨床上的自身修復多以纖維軟骨組織的形式來填補缺損，采用自體組織或同種異體組織如自體骨軟骨復合物、軟骨細胞、軟骨膜等修復軟骨缺損，對緩解疼痛、恢復關節(jié)功能具有一定的

2、療效，但關節(jié)軟骨來源有限、供區(qū)周圍軟骨退變，修復區(qū)軟骨退變、免疫排斥反應等，都可使臨床遠期療效并不理想。組織工程軟骨為關節(jié)軟骨缺損的修復帶來了希望，成為關節(jié)外科的研究熱點，但軟骨損傷修復的機制仍不是很清楚，作為種子細胞的干細胞定向成軟骨細胞分化的效果與體內正常的軟骨細胞仍然有一定差異，而干細胞的來源有很多，如骨髓、脂肪、血液等，其中以骨髓間充質干細胞(bone marrow derived stem cells，BMSCs)最能模擬體內

3、軟骨損傷自我修復的過程?，F(xiàn)有很多促使干胞細胞分化為軟骨細胞的方法，但仍需進一步改善，因此一定程度上阻礙了組織工程軟骨的應用，因此了解干細胞，尤其是BMSCs定向成軟骨細胞分化的調控機理則顯得尤為重要。 已有報道指出 microRNAs在胚胎軟骨發(fā)育過程中表達有時間特異性，其對干細胞的增殖、分化起著重要作用，有可能參與調控軟骨組織的發(fā)育、成熟及生物學特性的維持。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一類長度約～22個核苷酸肽

4、的非編碼RNAs，在轉錄后染色體中發(fā)揮阻遏基因表達的功能[1，2]，主要是通過和靶mRNA序列堿基互補配對，導致靶mRNAs的裂解或抑制它們有效翻譯。在生物機體發(fā)育的不同階段，miRNAs廣泛參與機體生理、病理過程[3]，例如胚胎發(fā)育，細胞增殖、分化、凋亡等。在不同的動物中，約1～3％的基因為miRNAs[4]，約1/3的人類基因潛在的受miRNAs調控，且每個miRNA的平均靶基因大于200個[5]，英具有多基因調控的功能，在復雜的細

5、胞信號網絡中發(fā)揮著關鍵的作用，尤其是功能蛋白表達的控制方面，因此特殊的miRNAs將可能是調控BMSCs定向分化為軟骨細胞的關鍵因子。本課題在體外誘導BMSCs定向成軟骨細胞分化過程中檢測miRNAs(共10個：miR-140、miR-196b、miR—346、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表達情況，尋找差異性表達的miRNAs，試圖藉此誘導BMCS

6、s分化為軟骨細胞或改善其分化為軟骨細胞的能力和/或功能，同時尋找其相應的靶基因，將可能對軟骨再生醫(yī)學產生積極的科學意義。 目的： 1.研究胎兒和SD大鼠BMSCs體外定向成軟骨細胞分化過程中miRNAs的 變化。 2.預測表達有統(tǒng)計學差異的miRNAs的靶基因。 3.綜述miRNAs在軟骨領域的研究進展。 方法： 1.采用梯度密度離心法獲取胎兒和SD大鼠的BMSCs，體外擴增培養(yǎng)，

7、并通過觀察形態(tài)學，描繪生長曲線和計算倍增時間等方法了解其體外擴增生長的特性，及成軟骨誘導液對其生長擴增能力影響的研究。 2.運用成骨細胞誘導液和成脂肪細胞誘導液，分別在體外對BMSCs進行成骨細胞誘導和成脂肪細胞誘導，分別通過鈣結節(jié)染色和油紅O染色證實其具有體外多向分化的功能。 3.運用細胞團培養(yǎng)體系體外誘導BMSCs定向成軟骨細胞分化，分為2組：BMSCs細胞團+完全培養(yǎng)液；BMSCs細胞團+成軟骨細胞誘導液，培養(yǎng)3個

8、星期，分別在1w、2w、3w時間點收取細胞團塊，RNA標本置于—80℃冰箱和組織學檢測標本進行石蠟包埋切片。采用Alcian blue和Safranin O組織學染色方法，及幾型膠原免疫組化染色方法，對誘導后的BMSCs細胞團塊進行成軟骨鑒定。 4.收集所有誘導后的BMSCs細胞團塊標本，提取RNA進行實時定量RT—PCR檢測BMSCs定向成軟骨細胞分化過程中10個感興趣miRNAs(miR-140、miR-196b、miR—3

9、46、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表達情況。 5.統(tǒng)計分析實驗數(shù)據，獲得差異性表達的miRNAs，通過miRNAs數(shù)據庫預測相應的靶基因。 6.檢索國內外文獻，綜述miRNAs在軟骨領域的研究進展。 結果： 1.胎兒和SD大鼠的BMSCs體外擴增良好，形態(tài)學穩(wěn)定，胎兒BMSCs倍增時間與SD大鼠BMSCs倍增時間相似

10、，細胞體積和核均較大，成軟骨細胞誘導液促進BMSCs分化能力，減弱其增殖能力。 2.BMSCs在體外經過3w成骨細胞誘導，鈣結節(jié)染色呈陽性反應；經過3w成脂肪細胞誘導，細胞內脂滴油紅染色呈陽性反應；經過體外細胞團塊培養(yǎng)3w成軟骨細胞，組織學切片Alcian blue和Safranin O軟骨基質染色成陽性反應，證實獲取的BMSCs具有體外多向分化的功能。 3.BMSCs細胞團分別經完全培養(yǎng)液和成軟骨細胞誘導液培養(yǎng)3w后，

11、成軟骨細胞誘導液組纓胞團的Alcian blue和Safranin O染色呈陽性反應，同時п型膠原免疫組化染色也呈陽性反應，而完全培養(yǎng)液組細胞團塊相應的常規(guī)組織學染色和免疫組化染色呈陰性反應。 4.miRNAs的實時定量RT—PCR檢測結果提示，與對照組比，成軟骨細胞誘導組的miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表達量增加有顯著差異性，miR-134在胎兒標本中表達

12、增加，而在SD大鼠標本中表達降低，顯示其表達的組織特異性，而miR—367和miR—34b在兩組的表達差異不明顯，miR—290在sD大鼠誘導的和沒有誘導的BMSCs中均不表達。 5.透過miRNAs數(shù)據庫預測相應的靶基因，hsa—miR-196b對應同源盒蛋白(Homeobox protein Hox—B8)，hsa—miR—302a/b/367對應酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine—protein kinase JAK1)，r

13、no—miR—346對應核轉錄因子1(Nucleolar transcription factor1)，mmu—miR-140對應聚合酶5(polymerase，epsilon)，mmu—miR-134對應解聚素和金屬肽酶域33(a disintegrin and metallopeptidase domain33，ADMD33)，rno—miR—346對應Col2A1，TGF—β1/3，IGF-1，mmu—miR—34b對應ADAMT

14、S4/5，以上靶基因主要涉及軟骨發(fā)育、軟骨退變、細胞周期和炎癥信號通路等，需要進一步進行驗證和探索。 結論： 成功在體外培養(yǎng)胎兒和sD大鼠的BMSCs，且它們均具有多向分化的功能。BMSCs在體外定向成軟骨細胞分化過程中，miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表達量增加有顯著差異性，miR-134在胎兒標本中表達增加，而在SD大鼠標本中表達降低，顯示了其組織