人脂肪干細胞成軟骨誘導(dǎo)分化過程中MicroRNA的表達及細胞載體復(fù)合物軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究.pdf

1、第一部分人脂肪干細胞體外培養(yǎng)及細胞載體復(fù)合物誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究
　　目的：探討人脂肪干細胞體外培養(yǎng)方法以及對細胞載體復(fù)合物誘導(dǎo)成軟骨分化的研究。
　　方法：通過選擇性吸脂或其他腹部手術(shù)獲取3個樣品的脂肪組織，分離、消化獲取人脂肪間充質(zhì)干細胞（hADSCs），并經(jīng)過原代和傳代培養(yǎng)；MTT法檢測細胞生長情況并繪制hADSCs的生長曲線；收集第3代hADSCs，利用流式細胞術(shù)檢測hADSCs細胞表面分子標志（CD29、CD34、CD4

2、5、CD90和CD105）；hADSCs成脂誘導(dǎo)分化并使用油紅O染色法鑒定，hADSCs成骨誘導(dǎo)分化并使用免疫熒光檢測骨唾液酸蛋白（BSP）、骨橋蛋白（OPN）、骨連接蛋白（ON）的表達，利用阿利新藍染色和免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白的表達正式 hADSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化作用；將第3代hADSCs與不同濃度膠原纖維蛋白溶液混合制成細胞載體復(fù)合物凝膠，14d后進行阿利新藍染色以及免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白表達。
　　結(jié)果：體外分離、培養(yǎng)

3、出高活性 hADSCs，增值曲線呈 S形。細胞CD29、CD90、CD105呈陽性表達，CD34、CD45呈陰性表達。hADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，細胞呈類圓形，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)有透亮的脂滴，油紅 O染色色脂滴呈鮮紅色。成骨誘導(dǎo)后細胞呈為不規(guī)則形，免疫熒光檢測細胞表達骨唾液酸蛋白、骨橋蛋白、骨連接蛋白。hADSCs成軟骨誘導(dǎo)后細胞形態(tài)變?yōu)殇伮肥瘶?，阿利新藍染色細胞基質(zhì)呈藍色，免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白染色呈陽性。阿利新藍染色細胞載體復(fù)合物成藍色，

4、免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白結(jié)果顯示，混合膠原蛋白組較單一膠原蛋白組更強陽性表達。
　　結(jié)論：成功分離培養(yǎng)出高度同源性hADSCs，具有多分化潛能。膠原纖維蛋白復(fù)合的支架載體，通過混合培養(yǎng)誘導(dǎo) hADSCs成軟骨細胞分化，可以作為修復(fù)軟骨缺損的理想載體支架材料。
　　第二部分人脂肪干細胞軟骨分化過程中MicroRNA的表達
　　目的：檢測人脂肪干細胞向軟骨細胞分化過程中的 MicroRNA（miRNA或者miR）表達譜，并

5、確認該過程中MicroRNA影響軟骨分化的潛在機制。
　　方法：（1）通過選擇性吸脂或其他腹部手術(shù)獲取3個樣品的脂肪組織，分離和培養(yǎng)人脂肪干細胞（hADSCs）；（2）利用流式細胞儀檢測hADSCs表面標記物（CD29、CD44、CD49和CD45）；（3）hADSCs經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)后分化，免疫組化檢測軟骨細胞相關(guān)蛋白的表達；（4）然后通過MicroRNA列陣獲得MicroRNA表達譜，篩選出20個miRNAs具有至少2倍的差異性

6、表達，這些miRNA包括12上調(diào)miRNAs和8下調(diào)miRNAs。Northern印跡分析進一步證實了miRNAs的表達水平，并通過 Northern印跡分析加以證實；（5）利用 TargetScan（ www.targetscan.org）、MiRanda（ www.microrna.org）和 miRBase（microrna.sanger.ac.uk）等算法預(yù)測 miRNAs的假定靶基因，并利用Western印跡分析檢測所預(yù)知靶基

7、因，熒光素酶報告基因分析加以證實；（6）利用功能分析來檢測在 hADSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化中miR-196a和miR-490-5p的作用。用miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染這些細胞，并用ELISA量化測定軟骨細胞誘導(dǎo)分化標志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表達；（7）用BMPR2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hADSCs，并經(jīng)過向軟骨細胞誘導(dǎo)分化孵育后，Western印跡分析檢測BMPR2蛋白的表達。ELISA量

8、化測定軟骨細胞誘導(dǎo)分化標志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表達。
　　結(jié)果：（1）第3代hADSCs是包括小的，單個圓形或幾個成團懸浮在培養(yǎng)基中，經(jīng)過流式細胞儀檢測細胞表面標記物：細胞陽性表達CD29，CD44和CD49，陰性表達CD45；（2）hADSCs經(jīng)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞形態(tài)呈多邊形（這是軟骨細胞典型的形態(tài)學(xué)特征），利用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白表達明顯升高，證明 hADSCs向軟骨細胞分化

9、；（3）利用miRNA微陣列芯片進行檢測3組樣品的hADSCs經(jīng)過軟骨誘導(dǎo)分化前、后的hADSCs的miRNA的表達水平，軟骨誘導(dǎo)分化前、后差異表達至少2倍的hADSCs的miRNA，包括12個上調(diào)miRNA（miR-196a，miR-143，miR-383，miR-193b，miR-7i，miR-26a，miR-539， miR-199a-3p，miR-337-5p，miR-146a-5p，miR-646和 miR-381）和8個下調(diào)

10、 miRNA（ miR-490-5p， miR-1307， miR-125b， miR-96-3p， miR-302-3p，miR-23a-3p，miR-590和 miR-510）。（4）使用 Northern印跡分析檢測8個已利用微列陣證實了，具有代表性差異性表達的miRNAs，包括4個上調(diào)的 miRNAs（miR-196a，miR-193b，miR-383和miR-143）和4個下調(diào)的miRNAs（miR-490-5p，miR-13

11、07，miR-125b和miR-590）。Northern印跡分析顯示miR-196a在3個樣品中均過表達， miR-490-5p在3個樣品中均明顯下調(diào)。（5）我們利用功能分析來檢測在 hADSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化中這2個 miRNAs（miR-490-5p和miR-196a）的作用。然而，我們僅發(fā)現(xiàn)miR-490-5p在軟骨誘導(dǎo)分化過程中具有明顯的作用，miR?196a卻沒有（數(shù)據(jù)未表明）。但是，在分化的第12天，用 miR-490

12、-5p慢病毒轉(zhuǎn)染這些細胞，與對照慢病毒組比較，到第18天時細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。我們使用ELISA量化測定軟骨細胞誘導(dǎo)分化標志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan），在第12天，第15天和第18天，細胞表面標記物的水平逐漸上調(diào)；但是，經(jīng)過miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞，這些標志物表達下調(diào)。這些結(jié)果表明miR-490-5p抑制hADSCs向軟骨細胞分化。（6）生物信息學(xué)分析證實了SOX-2和BMPR2作為miR

13、-490-5p的假定的靶基因，與軟骨細胞分化有關(guān)。利用 Western印跡分析檢測所預(yù)知靶基因 SOX-2和 BMPR2的蛋白表達，結(jié)果表明經(jīng)過軟骨細胞誘導(dǎo)分化的 hADSCs，其 SOX-2和 BMPR2的表達水平上調(diào)；將這些誘導(dǎo)分化后的 hADSCs用miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染后，其BMPR2的表達水平下調(diào)，而SOX-2的表達并未受到明顯影響。熒光素酶報告分析證實了 miR-490-5p抑制BMPR23'UTR螢光素酶40％的活

14、性，而用突變的BMPR23'UTR轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性被完全逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果說明BMPR2是的miR-490-5p的直接靶標。（7）用BMPR2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hADSCs，并經(jīng)過向軟骨細胞誘導(dǎo)分化孵育后，免疫組化檢測表明BMPR2蛋白表達以時間依賴的方式顯著下降，其Ⅱ型膠原蛋白表達下調(diào)；ELISA分析發(fā)現(xiàn) Col2A1、Col10A1和aggrecan的表達水平在第12天，第15天和第18天均下調(diào)。
　　結(jié)論：我們證實了一組