兩種Bt融合基因抗蟲(chóng)性能及其轉(zhuǎn)基因水稻的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)Bt(蘇云金芽孢桿菌,Bacillus thuringiensis)基因抗蟲(chóng)作物的廣泛應(yīng)用,人們對(duì)昆蟲(chóng)抗性發(fā)生的憂慮日益激增,對(duì)抗性管理的研究也越來(lái)越深入。目前在分子水平使用的抗性管理策略主要是基因堆疊,即將兩種或更多作用位點(diǎn)不同,無(wú)交叉抗性的Bt基因同時(shí)在一種作物中表達(dá)。這種策略己被證明能夠顯著延緩抗性發(fā)生。同時(shí),多基因的使用,還可以使轉(zhuǎn)基因作物同時(shí)應(yīng)對(duì)多種害蟲(chóng),可謂一舉兩得?；蚨询B有兩種實(shí)現(xiàn)方式,一種比較常見(jiàn),是將多種基因獨(dú)

2、立的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而另一種是將兩種基因拼接起來(lái),通過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)。一般認(rèn)為,兩種Bt基因融合的效果等同于兩種親本蛋白的疊加。
　　 cry1Ab和cry9Aa基因,氨基酸序列相似度低于30％,理論上講受體結(jié)合位點(diǎn)可能不同,因此不會(huì)出現(xiàn)交叉抗性。我們選取這兩個(gè)cry基因,去除兩者原蛋白結(jié)構(gòu)域ⅢC端的編碼基因,保留其經(jīng)典3結(jié)構(gòu)域(Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ)的活性部分。然后將兩個(gè)截?cái)嗟幕蚱唇悠饋?lái),形成融合基因,cryIAb-cry9Aa。大腸桿

3、菌(Escherichia coli)表達(dá)的融合蛋白CrylAb-Cry9Aa生物測(cè)定顯示,該蛋白對(duì)粘蟲(chóng)(Mythimna separate)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacatis)具有很好的殺蟲(chóng)活性,其LC50遠(yuǎn)低于其親本蛋白Cry1Ab和Cry9Aa。對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)和斜紋夜蛾(Spodoptera litura)的生測(cè)結(jié)果顯示,Cry1Ab和Cry9Aa蛋白對(duì)其沒(méi)有明顯的殺蟲(chóng)或抑制

4、作用,但融合蛋白Cry1Ab-Cry9Aa對(duì)兩種昆蟲(chóng)具有顯著生長(zhǎng)抑制作用。其中,喂養(yǎng)Cry1Ab-Cry9Aa蛋白(5μg／cm2)的棉鈴蟲(chóng)平均體重只有空白對(duì)照的十分之一,而斜紋夜蛾約為5分之一。我們進(jìn)一步將Cry9Aa的N端59個(gè)氨基酸去除,得到Cry9AaDel蛋白。同時(shí)將Cry1Ab和Cry9AaDel融合形成Cry1Ab-Cry9AaDel蛋白。生物測(cè)定顯示,Cry9AaDel完全失去對(duì)粘蟲(chóng)和亞洲玉米螟的活性,但是,相應(yīng)的融合蛋

5、白Cry1Ab-Cry9AaDel卻依然保持對(duì)兩種昆蟲(chóng)的高效殺蟲(chóng)活性。另外,Cry9AaDel對(duì)棉鈴蟲(chóng)和斜紋夜蛾也無(wú)任何活性,但融合蛋白Cry1Ab-Cry9AaDel也表現(xiàn)出同Cry1Ab-Cry9Aa蛋白相近的抑制作用。
　　 為了測(cè)定兩種融合蛋白對(duì)四種害蟲(chóng)的生物活性是否由于其親本蛋白之間的協(xié)同作用,我們同時(shí)將各自的兩種親本蛋白混合進(jìn)行生物測(cè)定。結(jié)果顯示,Cry1Ab和Cry9Aa或Cry9AaDel之間并無(wú)協(xié)同作用。兩種融

6、合蛋白對(duì)四種害蟲(chóng)的生物活性,也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于混合處理。該結(jié)果說(shuō)明我們構(gòu)建的兩種融合蛋白Cry1Ab-Cry9Aa和Cry1Ab-Cry9AaDel獲得了更高的生物活性,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 為了進(jìn)一步確認(rèn)兩種融合蛋白在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的應(yīng)用潛力,我們將兩種融合基因分別轉(zhuǎn)化水稻品種粳稻秀水110。分析陽(yáng)性轉(zhuǎn)化水稻中融合蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)兩種融合蛋白在水稻中均能較好表達(dá)。不同轉(zhuǎn)化株系之間表達(dá)量差異較大(0.2-2μg每克新鮮葉片)。另外,

7、在水稻里表達(dá)的融合蛋白,部分被水稻自身的蛋白酶消化,降解為較小的片段,該現(xiàn)象也已有其它相似的報(bào)道。對(duì)四種害蟲(chóng),棉鈴蟲(chóng)、斜紋夜蛾、二化螟(Chilo,suppressalis)和稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)等一齡幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定顯示,兩種轉(zhuǎn)基因水稻都獲得了優(yōu)秀的抗蟲(chóng)能力。進(jìn)一步使用單拷貝轉(zhuǎn)化株系的T1代植株測(cè)定二齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng),也表現(xiàn)出很好的抗性。
　　 綜上所述,獲得了兩種Bt融合蛋白Cry1A