超短程化療對(duì)脊柱結(jié)核患者外周血基因表達(dá)譜變化的研究.pdf

1、目的：
　　探討超短程化療前后脊柱結(jié)核患者臨床療效與外周血mRNA基因表達(dá)譜差異基因變化的關(guān)系；研究Krüppel樣因子4（KLF4）調(diào)控的TLR-2/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在脊柱結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：
　　1.收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院脊柱骨科收治的27例采用超短程化療及徹底病灶清除術(shù)治療的脊柱結(jié)核患者為實(shí)驗(yàn)組。所有脊柱結(jié)核患者均經(jīng)病理及手術(shù)證實(shí)，男13例，女14例，年齡17-72歲，平均38.8

2、±15.6歲。將27例脊柱結(jié)核患者分為三組：未治療組（A組）8例、超短程化療結(jié)束組（B組）9例、隨訪一年組（C組）10例。采用2SHRZ/2-4HRZ方案且小于6個(gè)月的超短程化療方案，手術(shù)方案均采用徹底病灶清除、病椎間植骨融合及器械內(nèi)固定術(shù)式。對(duì)照組為5例非結(jié)核住院患者，男3例，女2例，年齡25-50歲，平均35.2±12.7歲。
　　2.采集所有患者外周靜脈血10 mL，提取總RNA，利用昂飛Affymetrix U133 Pl

3、us2.0 Array芯片進(jìn)行外周血表達(dá)譜芯片的檢測(cè)。通過芯片顯著性分析軟件（SAM）分析得到各組之間的差異表達(dá)基因，對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析，并利用分子功能注釋系統(tǒng)（MAS）系統(tǒng)獲得 pathway通路，然后進(jìn)行差異基因功能分析，對(duì)獲得的差異表達(dá)基因采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法驗(yàn)證。
　　3.收集并對(duì)比分析脊柱結(jié)核患者的臨床資料，觀察超短程化療治療脊柱結(jié)核的臨床療效，同時(shí)對(duì)不同治療階段脊柱結(jié)核患者外周血中的腫瘤壞死因子α(T

4、NF-α)、干擾素γ（IFN-γ）、白介素12（IL-12）、白介素8（IL-8）及核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)并應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)外周血中的NF-κB蛋白。
　　4.挑選脊柱結(jié)核患者組即A組和正常對(duì)照組兩組的外周血白細(xì)胞差異表達(dá)的mRNA基因進(jìn)行研究，對(duì)比分析A組和正常對(duì)照組兩組患者的臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、血沉（ESR）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）及影像學(xué)檢查等。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)A

5、組和正常對(duì)照組兩組外周血中KLF4、Toll樣受體2（TLR-2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB基因在mRNA水平的表達(dá)；應(yīng)用ELISA法對(duì)IFN-γ、TNF-α、白介素1（IL-1）進(jìn)行檢測(cè)；應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)外周血白細(xì)胞中KLF4、TLR-2、磷酸化p38（p-p38）MAPK、p38 MAPK、NF-κB蛋白的表達(dá)。利用佛波酯（PMA）誘導(dǎo)人單核細(xì)胞（THP-1）為巨噬細(xì)胞，脂多糖（LPS）作用

6、于巨噬細(xì)胞，在 mRNA和蛋白水平檢測(cè)巨噬細(xì)胞中 TLR-2、p-p38、p38、NF-κB、KLF4的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.臨床結(jié)果顯示 A組結(jié)核病灶活動(dòng)；B、C兩組結(jié)核病灶治愈且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B、C三組表達(dá)譜芯片SAM分析結(jié)果顯示，A、B組之間顯著差異表達(dá)基因共942條，上調(diào)基因936條、下調(diào)基因6條； A、C組之間顯著差異表達(dá)基因276條，上調(diào)基因256條、

7、下調(diào)基因20條；B、C組之間無顯著差異表達(dá)基因。MAS分析顯示差異基因主要參與炎癥反應(yīng)及宿主的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的過程。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。A組較 B、C兩組 TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-8表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與 NF-κB的表達(dá)水平相一致。
　　2.脊柱結(jié)核組即A組和正常對(duì)照組兩組的臨床結(jié)果顯示，相對(duì)于正常對(duì)照組，脊柱結(jié)核組ESR、CRP、中性粒細(xì)胞相對(duì)值升高，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞

8、相對(duì)值及血紅蛋白值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芯片結(jié)果提示脊柱結(jié)核患者與正常對(duì)照組之間顯著差異表達(dá)基因共68條，上調(diào)基因16條，下調(diào)基因52條，其中KLF4基因在脊柱結(jié)核患者外周血中表達(dá)最為顯著，升高2.89倍。RT-PCR結(jié)果顯示脊柱結(jié)核患者較正常對(duì)照組外周血KLF4、TLR-2、p38、NF-κB基因在mRNA水平均高表達(dá)，IFN-γ、TNF-α、IL-1表達(dá)亦升高，同時(shí)KLF4、TLR-2、p-p38、NF-κB蛋白表達(dá)水平增加，差

9、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但p38蛋白水平卻無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在100 ng/mL LPS作用后的巨噬細(xì)胞中TLR-2、p-p38、NF-κB、KLF4在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平明顯增加，IFN-γ、TNF-α及IL-1的表達(dá)也明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.超短程化療治療脊柱結(jié)核的臨床療效與外周血mRNA差異基因、炎性細(xì)胞因子及核轉(zhuǎn)錄因子κB蛋白表達(dá)水平一致。
　　2.外周血