結核患者α-βTCR基因重排及CDR3譜型分析.pdf

1、研究背景和目的：結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的嚴重威脅人類健康的慢性傳染病。MTB屬細胞內感染菌，其免疫主要是以T細胞為主的細胞免疫。T細胞通過TCR識別抗原，識別過程還受細胞表面的MHC分子限制。TCR分別由α/β或γ/δ兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的膜結合型異二聚體。其中TCRα/β型大約占95％，在免疫中起主要作用。MTB感染后，T淋巴細胞通過其TCR特異的結合單核-巨噬

2、細胞遞呈的抗原，進而介導一系列的免疫反應。 由于TCR的α和β鏈分別由Vα-Jα-Cα及Vβ-Dβ-Jβ-Cβ基因片斷重排后編碼，可構成具有不同特異性的TCR分子，由此決定T細胞識別抗原的多樣性和特異性，從而可對環(huán)境中千變萬化的抗原產生特異性應答。目前已知TCRVα分為32個功能性基因家族，TCRVβ分為24個基因家族。TCR重排過程中，V-(D)-J的基因片段進行重排和隨機插入核甘酸(N區(qū))形成一高度可變區(qū)，稱為互補決定區(qū)3(

3、CDR3)。通過對CDR3序列的分析，可作為判別T細胞克隆性的指標。 目前，有關不同疾病個體TCRVα、Vβ限制性取用及CDR3譜型的研究范圍廣泛涉及感染性疾病、自身免疫性疾病、血液病、腫瘤等領域。但是有關結核病人TCR克隆性增殖的研究報道較少。TCR譜型的研究方法主要有：定量PCR、PCRDNA印跡、PCR-單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、PCR-序列分析和PCR-Genescαn(基因掃描)-序列分析等多種方法。近年來多采用TC

4、RVα32個家族、TCRVβ24個家族分別設計上游引物，針對TCR保守的C區(qū)或選取J區(qū)設計下游引物，分別配對擴增TCR序列中包括CDR3區(qū)的部分區(qū)域。獲得PCR產物直接或克隆后測序，通過分析其TCR取用特點和CDR3譜型研究其與疾病的關系。此方法雖然較為靈敏和準確，但是分別配對擴增工作量相對較大。因此有必要建立一種相對較為簡化的多重PCR擴增方法。而且，以往的研究多集中于TCRβ鏈，但是，對于α/βT細胞TCR的功能性研究應包括α和β鏈

5、。 我們的目的是建立TCRα和β鏈多重PCR擴增方法，并擴增出結核病人病變局部標本中特異性淋巴細胞TCRα和β鏈全長序列。擴增的PCR產物進行克隆并測序，測序結果利用DNAstαr軟件及網上TCR資源進行分析比對，進而研究結核病人在結核活動期是否存在T細胞克隆性增殖，確定TCRVα、Vβ以及Jα、Jβ所屬家族，研究特異性克隆增殖T細胞TCR譜的取用格局，以及TCRα和TCRβ鏈各自的CDR3譜型，為進一步研究MTB特異反應性TC

6、R四聚體建立基礎。 研究內容和方法：分離活動性肺結核病人肺泡灌洗液(BAL)和胸水(PLF)標本中的淋巴細胞，胸水標本分離的淋巴細胞進一步分離CD4+、CD8+細胞，然后分別提取其總RNA。胸水標本分離的部分淋巴細胞染色后進行流式細胞分析。提取的RNA利用AltasSwitchMechanismAtthe5'-endofReverseTranscript(SMART)方法逆轉錄并進行LDPCR合成cDNA第二鏈。根據現有文獻設計

7、能擴增包括TCRα和TCRβ鏈先導序列起始密碼的各自特異上游擴增引物，及根據TCRC區(qū)保守序列設計的下游引物(包括終止密碼)，進行多重PCR擴增，以分別獲得TCRα和TCRβ全長編碼序列。獲得的PCR產物回收后用限制性內切酶進行酶切，與相應的酶切處理的載體純化產物進行連接反應。連接產物轉化感受態(tài)細菌JM109，挑取氨芐青霉素抗性單菌落經培養(yǎng)后小量提取質粒，然后用相應的內切酶進行酶切鑒定。陽性克隆委托公司測序。測序結果用DNAstar軟件

8、及網上TCR資源進行分析、比對，確定擴增序列TCRVα、TCRVβ所屬亞家族，研究T細胞的克隆增殖情況、TCR譜取用格局及各TCRα和TCRβ鏈的CDR3堿基和氨基酸序列。 結果：活動性肺結核肺泡灌洗液標本3例，磁珠分離純化結核胸水標本CD4+、CD8+淋巴細胞2例并分別擴增出TCRα和TCRβ鏈PCR產物。α鏈長800bp左右，β鏈長900bp左右。PCR擴增產物經克隆測序共獲得65個α鏈全長序列，38個β鏈全長序列。

9、 序列結果分析：TCRα鏈以AV1S2、AV12S3、AV12S2、AV12S1為主，主要集中于AV1S2(50.8％)、AV12S3(46％)；TCRβ鏈以BV2、BV29S1、BV14、BV4S1、BV4S2為主，主要集中于BV2(36.8％)、BV29S1(52.6％)。 氨基酸序列分析顯示同一病例及不同病例之間CDR3區(qū)呈現多樣性，但是在BAL及PLF標本中，各病例內或病例之間也發(fā)現有個別相同或相似的氨基酸序列：BAL標

10、本1、BAL標本3與PLF標本1、PLF標本2的CD8+各有一條β鏈的CDR3區(qū)具有相同的氨基酸序列：SVGTGTLHQETQY；BAL標本2和BAL標本3的各有2條α鏈有相同的CDR3序列：AVRDWAGNMLT；PLF標本2的CD4+、CD8+淋巴細胞各有2條α鏈有相同的CDR3序列：AVRDQNYQLI。在某些不同的克隆也存在不同長度的相同基序。在BAL標本2的一個α鏈和一個β鏈的CDR3均有：AV…DNN…RLW序列；在PLF標

11、本1的CD8+淋巴細胞的兩條α鏈CDR3均含有：AMSDGN…NMLT；在PLF標本2的CD8+淋巴細胞的兩條α鏈CDR3均含有：AM…DDKII。 8例活動性肺結核病人PLF標本流式分析結果：CD4+、CD8+T淋巴細胞分別約占PLF總細胞的40％～60％和20％～30％。 結論：建立多重PCR方法擴增活動性結核患者病變局部標本TCRα和β鏈全長序列，既減少以往針對TCRVα、TCRVβ各亞家族分別進行擴增的工作量，又

12、能滿足臨床小量樣本的要求。 序列分析提示結核患者病變局部存在特異性T細胞的克隆性增殖，TCRα和β鏈譜型呈限制性取用?？寺≡鲋车腡CRCDR3氨基酸序列呈多樣性特點，但是在同一患者及不同患者也存在個別相同的CDR3氨基酸序列，提示這些相同的CDR3氨基酸序列對于識別MTB多肽可能具有特異性。 流式細胞及TCR序列分析結果顯示，在結核患者病變局部存在結核特異性T淋巴細胞的集聚。集聚的T細胞以CD4+T細胞為主(40％～60