浸礦微生物氧化亞鐵硫桿菌抗氟基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、背景與目的:氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是1947年分離出來的新菌種,這是一種專性自養(yǎng)及極端嗜酸性的硫桿菌,它廣泛分布在土壤、海水、硫磺泉以及沉積泉中,廣泛應(yīng)用于低品位銅礦、鈾礦以及其他多種貴金屬的浸出和回收,它是目前生物冶金中研究最多、最有經(jīng)濟(jì)效益的浸礦微生物。但是,由于該菌生長緩慢、細(xì)胞得率低,而且對鈾、氟等一些離子缺乏抗性,所以在實(shí)際應(yīng)用中限制了其應(yīng)用范圍,同時也對研究工作帶來很多不

2、便。本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)技術(shù),克隆抗氟基因flr-4,將其導(dǎo)入T.f1中,以期獲得穩(wěn)定遺傳的抗氟基因工程菌。
　　方法:1.應(yīng)用 RT-PCR技術(shù),從秀麗隱桿線蟲中克隆抗氟基因(flr-4),構(gòu)建pET30a-flr-4原核表達(dá)載體,將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用SDS-PAGE及Western blot檢測Flr-4蛋白的表達(dá),通過生長動力學(xué)曲線,檢測大腸桿菌抗氟能力的變化。2.構(gòu)建pJRD215-flr-4載體,將

3、其導(dǎo)入大腸桿菌SM10后,利用接合轉(zhuǎn)移技術(shù),將載體導(dǎo)入T.f1,檢測pJRD215-flr-4的遺傳穩(wěn)定性,比較野生型T.f1和重組T.f1菌株在不同氟離子濃度條件下生長動力學(xué)曲線。
　　結(jié)果:1.克隆了抗氟基因 flr-4,構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pET30a-flr-4,將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)后,檢測到大腸桿菌中有特異性的融合蛋白的表達(dá)。野生型大腸桿菌BL21(DE3)在NaF為9.6g/L的TB培養(yǎng)基中生長受到抑制,

4、而有融合蛋白 Flr-4表達(dá)的重組大腸桿菌 BL21(DE3)其生長不受影響。2.構(gòu)建了pJRD215-flr-4載體,通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入T.f1,野生型T.f1在NaF濃度為40mg/L以上就不再生長,而且在 NaF濃度為20mg/L時到達(dá)穩(wěn)定期時間為8天,重組T.f1在NaF濃度為60mg/L的情況下仍能生長,且在NaF濃度為20mg/L的情況下到達(dá)穩(wěn)定期由原來8天縮短為4天。將重組T.f1在無選擇壓力的條件下,連續(xù)傳代50代,質(zhì)粒保

5、留70％以上。
　　結(jié)論:1.通過RT-PCR技術(shù)從秀麗隱桿線蟲中克隆出抗氟基因flr-4,構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pET30a-flr-4,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)中。2.利用 SDS-PAGE和Western blot技術(shù)檢測到融合蛋白Flr-4在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá),并證實(shí)了抗氟基因的表達(dá)增強(qiáng)了大腸桿菌的抗氟能力。3.構(gòu)建了pJRD215-flr-4表達(dá)載體,通過接合轉(zhuǎn)移將載體導(dǎo)入到氧化亞鐵硫桿菌T.