PI3K-PKB-Akt-GSK-3β信號通路在FGF-2心肌保護中的作用研究.pdf

1、缺血性心臟病是導致人類死亡的重要原因，探索對抗缺血受損心肌的保護方法及其機制是心血管領域的一個研究重點與熱點，具有十分重要的理論與應用價值。
　　缺血性心臟病及其術后并發(fā)癥（如再灌注損傷）存在不同程度的心肌細胞凋亡。心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusioninjury，IRI）的主要病理機制之一，它與心肌IRI的發(fā)生與發(fā)展密切相關。心肌細胞凋亡的數(shù)量決定心肌損傷的程度，嚴重時可引起心功能障礙，甚至

2、心功能衰竭。在缺血再灌注時，通過抑制心肌細胞凋亡可以顯著縮小心肌梗死面積和有效減少心功能紊亂的發(fā)生。
　　研究表明，成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）能促進細胞的增殖、遷移，促進血管新生，改善心肌血供，對抗心肌壞死和凋亡，對缺血心肌具有較好的保護作用，可為對抗缺血引起的心肌損傷提供新思路。FGFs是具有22個成員的肝素生長因子家族，其中成纖維細胞生長因子-2（Fibroblast g

3、rowth factor-2，F(xiàn)GF-2，又稱堿性成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast growth factor,bFGF））的作用倍受關注。FGF-2是多功能生長因子，能促進細胞增殖、分化和遷移，具有強大的促血管新生作用。研究表明，F(xiàn)GF-2是一種重要的內(nèi)源性細胞保護物質(zhì)，具有明顯的心肌保護作用。本課題組和其他研究者的實驗表明，F(xiàn)GF-2對缺血心肌的保護作用與其結合FGF受體1（FGFR1），激活蛋白激酶C（prot

4、ein kinase C，PKC）及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）等細胞內(nèi)信號通路相關。但PKC和MAPKs種類的多樣性及其亞類功能的不一致性使得這兩類蛋白激酶在介導FGF-2引起的心肌保護作用中情況變的復雜，而且FGF-2的心肌保護效應也難以完全用PKC、MAPKs的激活來解釋。因此，尋找FGF-2心肌保護作用的其它機制顯得十分必要和重要。
　　糖原合成酶激酶

5、-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是一種在體內(nèi)廣泛表達的多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶。GSK-3可分布在細胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體和細胞核，而線粒體和細胞核中GSK-3活性要比細胞胞漿中的更高。人的GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β2個亞型。GSK-3α/β分別存在與其功能密切相關的2個非常重要的磷酸化位點——Tyr279/Tyr216和Ser21/Ser9。在細胞靜息狀態(tài)時，以Tyr279/Tyr216

6、磷酸化為主，使GSK-3α/β保持激活狀態(tài)，如Ser21/Ser9發(fā)生磷酸化，則抑制GSK-3α/β活性。大量的研究顯示，GSK-3β在心肌保護中具有非常重要的意義。各類具有心肌保護作用的信號通路匯聚于GSK-3β，使GSK-3βSer9磷酸化，抑制GSK-3β活性，從而縮小心肌梗死面積，拮抗心肌細胞凋亡，改善心功能，對抗心率失常，發(fā)揮心肌保護作用。
　　酪氨酸激酶受體FGFR1激活后，通常會激活PLC-PKC，Ras-MAPKs

7、和PI3K-PKB/Akt信號通路。研究表明，PI3K-Akt/PKB-GSK-3β信號通路在心肌保護中扮演重要角色。心肌缺血預處理（Ischemic preconditioning，IPC）、心肌缺血后處理（Ischemic postconditioning，IPostC）、硫化氫及一些藥物的抗心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）作用都與激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路

8、有關。文獻表明：FGF-2可以通過激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路，拮抗慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所誘導的神經(jīng)細胞凋亡；促進人胚神經(jīng)干細胞向運動神經(jīng)元細胞分化；使前列腺癌細胞發(fā)生上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）。PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路能否介導FGF-2的心肌保護作用？目前不清楚。
　　因此，本研究提出“FGF-2可能通過激活PI3K-PK

9、B/Akt-GSK-3β信號通路發(fā)揮心肌保護作用”的科學假設。為驗證這一假設，首先采用大鼠離體心臟缺血/再灌損傷模型和心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，觀察FGF-2對心肌梗死面積、心功能和心肌細胞凋亡的影響及PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路的變化；然后采用心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，探索GSK-3β如何介導FGF-2抗心肌細胞凋亡的作用。通過這些研究，旨在揭示FGF-2心肌保護作用的新機制和新途徑，進一步闡明這一重要的內(nèi)源性細

10、胞保護物質(zhì)的生理與病理意義，為缺血性心臟病的治療提供新思路和新的干預環(huán)節(jié)。
　　第一部分、FGF-2心肌保護作用的新機制探索
　　PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路的作用
　　目的：探索PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路在FGF-2心肌保護中的作用。
　　方法：
　　1．觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路在FGF-2對抗大鼠離體心臟IRI的作用。利用 Langendo

11、rff心臟灌流系統(tǒng)建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷（IRI）模型，47只SD大鼠隨機分為7組，每組6～7只：①缺血再灌注組（I/R）：K-H液灌流平衡30min，接著K-H液再灌流5分鐘，停灌30分鐘，復灌60分鐘；②I/R+LY294002組（LY294002）：在I/R的基礎上，在停灌前5分鐘和復灌的全程使用含有15μM的PI3K特異性抑制劑LY294002 K-H液灌流；③I/R+SH-5組（SH-5）：在I/R的基礎上，給予含有1

12、0μM PKB/Akt抑制劑SH-5的K-H液灌流，SH-5的使用方式與LY294002相同；④I/R+SB216763組（SB216763）：在I/R的基礎上，在再灌注前5分鐘和整個再灌注內(nèi)給予含有3μM GSK-3β抑制劑SB216763的K-H液灌流；⑤I/R+FGF-2組（FGF-2）：在I/R的基礎上，在復灌最初10分鐘給予含有FGF-2（10μ g/heart）K-H液灌流；⑥ I/R+FGF-2+LY294002組（FGF

13、-2+LY294002）：FGF-2與LY294002分別按FGF-2組和LY294002組的方式與劑量給與；⑦I/R+FGF-2+SH-5組（FGF-2+SH-5）：FGF-2與SH-5分別按FGF-2組和SH-5組的方式與劑量給與。采用1％氯化三苯基四氯唑（TTC）染色檢測心肌梗死面積；全自動生化分析儀測定冠脈流出液LDH活性；生物信息采集系統(tǒng)記錄左心室收縮壓（ LVSP）、左心室舒張壓（LVDP）、左室內(nèi)壓最大變化速率（dp/dt

14、max）；TUNEL結合DAPI染色檢測心肌組織細胞凋亡情況；Western blot檢測各組Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。
　　2．觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路在FGF-2對抗心肌細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷的作用。
　　（1）觀察FGF-2對正常心肌細胞Akt和GSK-3β活性的影響。用10ng/m

15、lFGF-2分別處理H9c2心肌細胞0、5、10、20、30、60分鐘，采用Western blot檢測Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達。
　?。?）觀察H/R對心肌細胞損傷及Akt與GSK-3β活性的影響。首先將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞隨機分為：①正常組；②缺氧90分鐘組；③缺氧90分鐘，復氧120分鐘組。采用CCK-8比色法檢測心肌細胞存活率。然后將H9c2心肌細胞依次缺

16、氧0、0.5、1、2小時，在缺氧2小時的基礎上，再依次復氧0.5、1、2、12和24小時，Western blot分別檢測Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表達水平。
　　（3）觀察FGF-2對H/R心肌細胞損傷及Akt與GSK-3β活性的影響。
　　H9c2心肌細胞隨機分為：①正常組；②H/R組；③H/R+FGF-2組。采用CCK-8比色法檢測心肌細胞存活率；流式細胞術和TUNEL檢測心肌細胞凋亡率；We

17、stern blot分別檢測Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表達水平。
　?。?）觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路在FGF-2對抗H/R所誘導心肌細胞損傷的作用。首先，將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞隨機分為：①正常組（ Control）；②H/R組；③H/R+FGF-2組（ FGF-2）；④H/R+FGF-2+LY294002組（FGF-2+LY294002）；⑤H/R+FGF-2+ SH-5組

18、（FGF-2+SH-5）。以含10ng/ml FGF-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細胞30分鐘后，缺氧90分鐘，復氧120分鐘，其中10μmol/L LY294002或5μmol/L SH-5在缺氧前1小時加入。復氧結束后，采用CCK-8比色法檢測心肌細胞存活率；TUNEL和流式細胞術檢測心肌細胞凋亡；采用Western blot檢測Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達。然后，觀察GSK-3β-WT、具有較高激酶活性

19、的GSK-3β-S9A突變體和激酶活性喪失的GSK-3β-K85R突變體對心肌細胞GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達的影響。將V5Tag標記的pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-S9A、pcDNA3/GSK-3β-K85R質(zhì)粒擴增，抽提和測序。接著將pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-S9A和pcDNA3/GSK-3β-K85R分別轉(zhuǎn)染心肌細胞。質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染48小時后，采用West

20、ern blot檢測各組細胞V5Tag的表達水平。隨后實驗分組：①空白對照組（Con）；②空載體組（Vec）；③GSK-3β-WT組（WT）；④GSK-3β-S9A組（S9A）；⑤GSK-3β-K85R組（K85R）。采用Western blot方法檢測GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達。最后，觀察FGF-2對H/R心肌細胞中凋亡相關蛋白的影響。將GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A突變體和GSK-3β-K85R突變

21、體成功轉(zhuǎn)染心肌細胞，實驗分組：①正常組（Control）；②H/R組；③H/R+ GSK-3β-K85R組（H/R+K85R）；④H/R+GSK-3β-S9A組（H/R+S9A）；⑤H/R+FGF-2組；⑥H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2組（H/R+S9A+FGF-2）。采用Western blot檢測細胞胞漿和線粒體中Bax蛋白表達，Bcl-2、32KD Caspase-3和17KD Caspase-3蛋白表達。
　　結

22、果：
　　1．離體心臟灌流研究發(fā)現(xiàn)，在復灌時給予FGF-2，心肌梗死面積較缺血再灌注組減少42.3%（P<0.01），冠脈流出液中LDH活性降低32.8%（P<0.01），LVSP增加25.8%，LVDP增加38.5%，dp/dtmax絕對值分別增加35.9%和52.0%（均P<0.01），心肌細胞AI（apoptosis index）降低52.3%（P<0.01），p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分別增加1

23、12.5%和112.1%(均 P<0.01)。PI3K特異性抑制劑LY294002和PKB/Akt抑制劑SH-5可以對抗FGF-2的心肌保護作用，F(xiàn)GF-2+LY294002組心肌梗死面積較FGF-2組增加40.2%（P<0.05），冠脈流出液中LDH活性增加25.6%（P<0.05），LVSP降低12.6%，LVDP降低17.2%，dp/dtmax絕對值分別降低13.9%和22.4%（均P<0.05），p-Akt/Akt、p-GSK-

24、3β/GSK-3β比值分別下降27.7%和27%(均P<0.05)；FGF-2+SH-5組心肌梗死面積較FGF-2組增加29.5%（P<0.05），冠脈流出液中LDH活性升高20.0%（P<0.05），LVSP降低10.1%，LVDP降低13.4%，dp/dtmax絕對值分別下降9.9%和17.5%（均P<0.05），p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分別降低19.2%和20.3%(均P<0.05)。在復灌時給予GS

25、K3β抑制劑SB216763，心肌梗死面積較缺血再灌注組減少43.6%（P<0.01），冠脈流出液中LDH活性降低41.1%（P<0.01），LVSP增加29.9%，LVDP增加46.6%，dp/dtmax絕對值分別增加40.7%和58.7%（均P<0.01），p-GSK-3β/GSK-3β比值增加129.2%(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，LY294002組和SH-5組心功能、心肌梗死面積、冠脈流出液中LDH活性、p-Akt/A

26、kt、p-GSK-3β/GSK-3β比值變化無顯著差異（均P＞0.05）。
　　2．缺氧和H/R可以抑制心肌細胞活力（與正常組相比，P<0.01）。FGF-2可以明顯提高H/R心肌細胞存活率，拮抗H/R所誘導心肌細胞凋亡（與H/R組相比，所有P<0.05）；LY294002和SH-5可以對抗FGF-2的以上作用（與FGF-2組相比，所有P<0.05）。
　　3．在正常心肌細胞研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2可以動態(tài)調(diào)節(jié)心肌細胞Akt和G

27、SK-3β的活性；缺氧可以短暫性激活Akt，H/R先激活后抑制Akt的活性；缺氧可以短暫性抑制GSK-3β的活性，H/R先抑制后激活GSK-3β；FGF-2顯著促進H/R心肌細胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達（與H/R組相比，所有P<0.01），其作用能被LY294002或SH-5拮抗（與FGF-2組相比，所有P<0.05）。
　　4．測序結果顯示，GSK-3β-WT基因序列是正確的，GSK-3β-S9A突變體的9位絲氨酸確

28、實被丙氨酸取代，GSK-3β-K85R突變體的85位賴氨酸確實被精氨酸取代；本實驗所采用的方法可以將GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R有效轉(zhuǎn)染心肌細胞；GSK-3β-WT組、GSK-3β-S9A組和GSK-3β-K85R組p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯降低，以GSK-3β-S9A組最低（與空白對照組相比，P<0.05）。
　　5．H/R促進Bax由細胞胞漿轉(zhuǎn)入線粒體，激活Caspase-3及抑

29、制Bcl-2蛋白的表達（與正常組相比，P<0.05）；FGF-2和GSK-3β-K85R突變體可以抑制H/R的以上作用（與H/R組相比，P<0.05）；GSK-3β-S9A突變體可以逆轉(zhuǎn)FGF-2對H/R的抑制作用（與H/R+FGF-2組相比，P<0.05）。
　　結論：
　　1．FGF-2能拮抗大鼠心肌I/R損傷和心肌細胞H/R損傷，具有良好的心肌保護作用；
　　2．PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號通路的激

30、活介導 FGF-2拮抗的大鼠心肌I/R損傷和心肌細胞H/R損傷，是FGF-2心肌保護作用新的分子機制。
　　第二部分、線粒體GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌細胞凋亡中的作用
　　目的：探索GSK-3β介導FGF-2抗心肌細胞凋亡的機制。
　　方法：
　　1．觀察GSK-3β在 H/R心肌細胞凋亡中的作用。H9c2心肌細胞隨機分為：①正常組（Normal）；②H/R組；③H/R+Control s

31、iRNA組（Control siRNA）；④H/R+GSK-3βsiRNA組（GSK-3βsiRNA）；⑤H/R+SB216763組（SB216763）。心肌細胞成功轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA48小時后或預孵育3μM GSK3β選擇性抑制劑SB21676330分鐘后，接著缺氧90分鐘，復氧120分鐘。復氧結束后，采用TUNEL結合DAPI染色檢測各組心肌細胞凋亡情況。
　　2．觀察GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2對抗H

32、/R心肌細胞凋亡中的作用。將GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染心肌細胞，實驗分組：①正常組（Normal）；② H/R組；③H/R+GSK-3β-K85R組（GSK-3β-K85R）；④H/R+ GSK-3β-S9A組（GSK-3β-S9A）；⑤H/R+FGF-2組（FGF-2）；⑥H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2組（GSK-3β-S9A+ FGF-2）。采用TUNEL結合DAPI染色檢測各組心肌細胞凋亡情

33、況。
　　3．觀察FGF-2對線粒體p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達的影響。首先，觀察FGF-2對細胞GSK-3β蛋白表達的影響。心肌細胞隨機分為：①正常組（Vehicle）；②FGF-2組。采用免疫熒光檢測GSK-3β蛋白表達。接著，觀察FGF-2對細胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達的影響。心肌細胞隨機分為：①正常組（Vehicle）；②LY294002組；③FGF-2組；④FGF-2+LY294002組。采用免疫熒光

34、檢測p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達。最后， 觀察 FGF-2對線粒體和細胞胞漿GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達的影響。心肌細胞隨機分為：①正常組（Vehicle）；②FGF-2組。采用Western blot檢測線粒體和細胞胞漿中GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達。
　　4．觀察GSK-3βsiRNA對H/R心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響。H9c2心肌細胞隨機分為：①正常組；②H/

35、R組；③H/R+GSK-3βsiRNA組。采用Western blot檢測Bcl-2、細胞胞漿和線粒體Bax蛋白表達。
　　結果：
　　1．GSK-3βsiRNA和SB216763可以拮抗H/R心肌細胞凋亡（與H/R組相比，P<0.05）。
　　2．FGF-2和GSK-3β-K85R突變體抑制心肌細胞凋亡（與H/R組相比，P<0.05），GSK-3β-S9A突變體逆轉(zhuǎn)FGF-2對H/R心肌細胞凋亡的抑制作用（與H/R+

36、FGF-2組相比，P<0.05）。
　　3．FGF-2對心肌細胞GSK-3β蛋白表達無影響，F(xiàn)GF-2促進心肌細胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達，而且主要以線粒體p-GSK-3β(Ser9)表達為主。
　　4．GSK-3βsiRNA可以減輕H/R對Bcl-2蛋白表達的抑制作用，阻止Bax由細胞胞漿轉(zhuǎn)入線粒體（與H/R組相比，P<0.05）。
　　結論：線粒體GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌細胞凋