“標(biāo)本配穴”電針對(duì)心肌缺血大鼠細(xì)胞凋亡miRNA的影響及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　心血管疾病是當(dāng)今威脅人類健康和生命的主要疾病之一，心肌缺血是心血管疾病的主要因素。針刺用于防治心肌缺血已有數(shù)千年的歷史，具有操作簡(jiǎn)便快捷、療效確切的特點(diǎn)，但其作用機(jī)制尤其是分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不完全清晰，在一定程度影響了針灸在心肌缺血臨床的應(yīng)用及推廣。
　　相關(guān)研究表明，在心肌缺血的過(guò)程中存在普遍心肌細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，而細(xì)胞凋亡是受基因嚴(yán)格控制的，其中MicroRNA(miRNA)的調(diào)控具有關(guān)鍵作用。針刺是否是通過(guò)m

2、iRNA基因調(diào)控途徑干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡？主要是通過(guò)什么miRNA基因調(diào)控的？主要的miRNA基因是通過(guò)什么信號(hào)調(diào)控途徑發(fā)揮作用的？這些都是需用研究的問(wèn)題。
　　有據(jù)于此，本課題選用心肌缺血模型大鼠為研究對(duì)象，在中醫(yī)針灸“治未病”理論為指導(dǎo)下，采用“標(biāo)本配穴”電針干預(yù)方法，以細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，運(yùn)用miRNA基因芯片篩選、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）及蛋白質(zhì)印跡（Western blot）等技術(shù)，觀察心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)miRNA及

3、其靶基因表達(dá)的影響及調(diào)控關(guān)系，探討“標(biāo)本配穴”針刺干預(yù)心肌缺血的miRNA基因調(diào)控機(jī)制，以期為針刺防治心肌缺血疾病提供理論支撐和科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.選用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重180-220g，隨機(jī)分為正常組、模型組、內(nèi)關(guān)電針組（內(nèi)關(guān)組）、標(biāo)本配穴電針組（標(biāo)配組），每組10只。模型組、內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組大鼠予異丙腎上腺素(ISO)2mg/(kg·d)腹部皮下注射,連續(xù)14天，后用BL-420生物機(jī)能系

4、統(tǒng)檢測(cè)模型組大鼠心電圖，以QRS波、QT波持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)（QRS＞0.1s）、T波形態(tài)改變作為造模成功標(biāo)志。正常組大鼠給予等量0.9％生理鹽水腹部皮下注射，連續(xù)14天。
　　正常組、模型組大鼠只抓取固定，不針刺治療。內(nèi)關(guān)組針刺雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”（大鼠腕橫紋正中上5 mm，針刺深約0.5 cm），標(biāo)配組針刺雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”、“關(guān)元”（大鼠臍下約25 mm，針刺深約0.5 cm）、雙側(cè)“足三里”（大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約5mm，針刺深約0.

5、8 cm），標(biāo)配組同側(cè)穴位組成一對(duì)電極，內(nèi)關(guān)組及標(biāo)配組中內(nèi)關(guān)穴在穴位右旁開0.5cm處另皮下淺刺一針作輔助電極，后連接HANS LH202H電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度1mA，以大鼠肢體有震顫感為適宜強(qiáng)度，通電10min。每日治療1次，共21天。
　　大鼠于第22天行超聲心動(dòng)圖機(jī)檢測(cè)大鼠左室舒張末期內(nèi)徑( LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑( LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率（FS）；TUNEL法檢測(cè)大鼠心

6、肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）；ELISA法檢測(cè)血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）、內(nèi)皮素1（ET-1）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織 miRNA-133-3p、miRNA-133-5p、miRNA-1-3p、miRNA-486表達(dá)及靶基因Nol3、Caspase-3、Aifm2、Api5、RGD1564319、Aatk的表達(dá)。后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì) miRNA與其靶基因進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證。

7、>　　2.SPF級(jí)雄性Wistar大鼠12只，每組3只，分組、治療、取材方法同上。用微列陣基因芯片技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌miRNA表達(dá)譜狀況。
　　3.SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為正常組、模型組、內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、miRNA-133a-5p抑制劑組（抑制劑組）、miRNA-133a-5p激動(dòng)劑組（激動(dòng)劑組）、miRNA-133a-5p抑制劑+?標(biāo)本配穴?電針組（抑制劑+標(biāo)配組），每組10只。模型組、內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、抑制

8、劑組、激動(dòng)劑組及抑制劑+標(biāo)配組造模方法與上（方法1）相同。抑制劑組、抑制劑+標(biāo)配組腹部皮下按10mg/kg于實(shí)驗(yàn)第1、7、14天進(jìn)行 miRNA-133a-5p抑制（antagomir）劑注射，共3次；激動(dòng)劑組注射miRNA-133a-5p激動(dòng)（agomir）劑，劑量、方法同抑制劑組相同。正常組方法與上（方法1）相同。正常組、模型組、抑制劑組、激動(dòng)劑組大鼠只抓取固定，不針刺治療。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、抑制劑+標(biāo)配組進(jìn)行電針治療，抑制劑+標(biāo)配組

9、與標(biāo)配組治療方法相同，電針治療方法與上（方法1）相同。
　　實(shí)驗(yàn)第22天心臟取材，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠心肌組織miRNA-133-5p及其靶基因Caspase-3、Aifm2的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)各組靶基因Caspase-3、Aifm2的表達(dá)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.模型組大鼠心臟LVEDd、LVESD高于正常組（均為P＜0.01），而EF、FS值均低于正常組（

10、均為P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組LVEDd、LVESD均低于模型組（均為P＜0.01），標(biāo)配組低于內(nèi)關(guān)組（分別為P＜0.01, P＜0.05）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組中EF、FS值均高于模型組（均為P＜0.01），標(biāo)配組高于內(nèi)關(guān)組（P＜0.05）。
　　2.正常組大鼠心肌AI值低于模型組（P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組均低于模型組（均為P＜0.01）；標(biāo)配組低于內(nèi)關(guān)組（P＜0.05）。
　　3.模型組大鼠血清CK-MB、VCAM-

11、1、ET-1值均高于正常組（均為P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組均低于模型組（均為P＜0.01）；標(biāo)配組均低于內(nèi)關(guān)組(均為P＜0.05)。
　　4.運(yùn)用微陳列芯片技術(shù)共篩選出758個(gè)miRNA基因信號(hào)，有20個(gè)具有差異化意義的 miRNA基因信息：12個(gè)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)；其中miR-133a-5p和miR-133a-3p上調(diào)趨勢(shì)、miR-1-3p和miR-486下調(diào)趨勢(shì)明顯優(yōu)于其它miRNA基因。通過(guò)TargetScan、mi

12、Randa和PicTar3種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)交叉對(duì)上述4個(gè) miRNA基因與凋亡相關(guān)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)：miR-133a-3p的靶基因?yàn)?Nol3，miR-133a-3p的靶基因?yàn)?Caspase-3和Aifm2，miR-1-3p的靶基因?yàn)锳pi5，miR-486的靶基因?yàn)镽GD1564319和Aatk。
　　5.(1)模型組大鼠心肌miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達(dá)均低于正常組（均為P＜0.01），miRNA-1

13、-3p、miRNA-486表達(dá)均高于正常組（均為P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達(dá)均高于模型組（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），標(biāo)配組均高于內(nèi)關(guān)組（分別為P＜0.05，P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組miRNA-1-3p、miRNA-486表達(dá)均低于模型組（分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），標(biāo)配組均低于內(nèi)關(guān)組（均為P＜0.05）

14、。(2)模型組心肌 Nol3表達(dá)高于正常組（P＜0.01），模型組與內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組沒(méi)有顯著差異（均為P＞0.05）；模型組 Caspase-3、Aifm2表達(dá)均高于正常組（均為P＜0.01），內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組均低于模型組（均為 P＜0.01），標(biāo)配組均低于內(nèi)關(guān)組（均為 P＜0.01）；模型組Api5表達(dá)低于正常組（P＜0.01），內(nèi)關(guān)組與模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），標(biāo)配組低于模型組（P＜0.05）；正常組RGD1564319表達(dá)與模

15、型組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；模型組 Aatk表達(dá)高于正常組（P＜0.01），內(nèi)關(guān)組與模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），標(biāo)配組高于模型組（P＜0.05）。(3)整體組間相關(guān)性及相關(guān)系數(shù)強(qiáng)度分析：miRNA-133a-3p與Nol3、miRNA-1-3p與Api5為中度負(fù)相關(guān)；miRNA-486與Aatk為中度正相關(guān)；miRNA-486與RGD1564319為輕度負(fù)相關(guān)；miRNA-133a-5p與Caspase-3、Aifm2均為高度

16、負(fù)相關(guān)。
　　6.(1)模型組大鼠心肌miRNA-133a-5p表達(dá)低于正常組（P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組均高于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組低于模型組（P＜0.01）；標(biāo)配組、激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組均高于內(nèi)關(guān)組（分別為 P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），抑制劑組低于內(nèi)關(guān)組（P＜0.01）；激動(dòng)劑組高于標(biāo)配組（P＜0.01），抑制劑組低于標(biāo)配組（P＜0.01），抑制劑+標(biāo)配組與標(biāo)配組

17、無(wú)顯著差異（P＞0.05）。(2)模型組大鼠心肌 Caspase-3、Aifm2表達(dá)（qRT-PCR檢測(cè)）均高于正常組（均為 P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組均低于于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組高于模型組（分別為P＜0.01，P＜0.05）；標(biāo)配組、激動(dòng)劑組均低于于內(nèi)關(guān)組（均為P＜0.01），抑制劑組高于內(nèi)關(guān)組（均為P＜0.01），抑制劑+標(biāo)配組與內(nèi)關(guān)組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；抑制劑組高于標(biāo)配組（均為

18、P＜0.01），激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組與標(biāo)配組無(wú)顯著差異（均為 P＞0.05）。(3)模型組大鼠心肌 Caspase-3、Aifm2表達(dá)（Western-blot檢測(cè)）均高于正常組（均為P＜0.01）；內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組、激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組均低于于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組高于模型組（均為P＜0.05）；標(biāo)配組、激動(dòng)劑組均低于內(nèi)關(guān)組（均為P＜0.01），抑制劑組高于內(nèi)關(guān)組（均為P＜0.01），抑制劑+標(biāo)配組（Caspase

19、-3）與內(nèi)關(guān)組無(wú)顯著差異（P＞0.05），抑制劑+標(biāo)配組（Aifm2）低于內(nèi)關(guān)組（P＜0.01）；抑制劑組高于標(biāo)配組（均為 P＜0.01），激動(dòng)劑組、抑制劑+標(biāo)配組與標(biāo)配組無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。(4)整體組間相關(guān)性及相關(guān)系數(shù)強(qiáng)度分析：miRNA-133a-5p分別與 Caspase-3、Aifm2（ qRT-PCR、Western-blot檢測(cè)）均為較強(qiáng)負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.電針能夠通過(guò)降低心肌缺血模型大鼠

20、的LVEDd、LVESD值、提升EF、FS值，有效改善心肌缺血細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的代償性心臟擴(kuò)張、心功能低下，降低心肌細(xì)胞凋亡程度，且?標(biāo)本配穴?電針?lè)ū葐渭儍?nèi)關(guān)電針?lè)ň哂懈玫男?yīng)。
　　2.對(duì)于心肌缺血細(xì)胞凋亡后引發(fā)的心肌酶等指標(biāo)改變，“標(biāo)本配穴”電針和內(nèi)關(guān)電針?lè)ň芡ㄟ^(guò)有效減少實(shí)驗(yàn)大鼠血清CK-MB、VCAM-1及ET-1的活性表達(dá)發(fā)揮抗心肌缺血作用的，且“標(biāo)本配穴”電針?lè)ū葐渭儍?nèi)關(guān)電針?lè)ň哂懈玫男?yīng)。
　　3.多miRN

21、A基因參與了異丙腎上腺所致的大鼠心肌缺血細(xì)胞凋亡過(guò)程，心肌缺血過(guò)程中，主要表現(xiàn)在miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達(dá)下降，miRNA-1-3p、miRNA-486上升；?標(biāo)本配穴?電針?lè)軌蛲ㄟ^(guò)有效地提升miRNA-133-3p、miRNA-133-5p的表達(dá)，降低miRNA-1-3p、miRNA-486的表達(dá)，其保護(hù)作用是通過(guò)調(diào)控這4個(gè)miRNA基因的方式抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　4.miRNA基因及其靶基因是影