基于PI3K-Akt通路探討“標(biāo)本配穴”電針干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　心肌缺血是指各種原因?qū)е鹿跔顒用}血流量減少，從而引起心肌細(xì)胞氧等物質(zhì)供應(yīng)減少以及清除代謝產(chǎn)物能力降低的一種臨床病理生理狀態(tài)，在臨床上多見于冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。址Q為缺血性心臟病。近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活水準(zhǔn)極大地提高，以及飲食結(jié)構(gòu)的改變和人均期望壽命的延長，使我國缺血性心臟病發(fā)生率逐年上升，成為國人死亡的主要原因之一。因此尋找和探索有效防治缺血性心臟病的方法成為廣大醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)和

2、熱點(diǎn)。
　　現(xiàn)有研究針刺改善心肌缺血多選取單穴，其中以內(nèi)關(guān)、心俞為主要研究穴位，大多數(shù)并未考慮辨證論治施來加以配穴。多個穴位聯(lián)合效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制以及其效應(yīng)是否優(yōu)于單個腧穴，需要更進(jìn)一步的探討研究。本研究以慢性心肌缺血大鼠模型為研究對象，采用“標(biāo)本配穴”電針進(jìn)行針刺治療，并以單取“內(nèi)關(guān)穴”作為對照，通過觀察心電圖、心肌病理形態(tài)學(xué)、心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡指數(shù)及線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，分析“標(biāo)本配穴”治療對心肌缺血大鼠的保護(hù)作用，通過對PI

3、3K/Akt通路的激活和抑制，觀察PI3K/Akt通路及凋亡相關(guān)基因、蛋白等指標(biāo)的變化，系統(tǒng)整理和分析“標(biāo)本配穴”對慢性心肌缺血大鼠PI3K/Akt信號通路及相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的調(diào)控作用機(jī)制，探討“標(biāo)本配穴”對慢性心肌缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床腧穴配伍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　采用3月齡SPF級Wistar雄性健康大鼠140只，體重180-220g，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為7組：正常組、模型組、LY294002組

4、、IGF-1組、內(nèi)關(guān)組、標(biāo)本配穴組、標(biāo)本配穴+LY294002組，每組20只，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行造模及處理。除正常組外，其余6組均采用腹部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（ISO）方法復(fù)制成慢性心肌缺血模型，共注射14天，每天1次。LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組除造模外，還給予PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002溶液進(jìn)行腹部皮下注射，自造模開始至造模結(jié)束，一共14天，每天一次。IGF-1組除造

5、模外，另給予PI3K/Akt通路激活劑胰島素一號增長因子（IGF-1）進(jìn)行腹部皮下注射，也自造模開始至造模結(jié)束，一共14天，每天一次。內(nèi)關(guān)組除造模外，單取“內(nèi)關(guān)穴”進(jìn)行電針治療（在“內(nèi)關(guān)穴”右側(cè)旁開0.5cm處再淺刺一針作為輔助電極）；標(biāo)本配穴組和標(biāo)本配穴+LY294002組則取“內(nèi)關(guān)穴”、“足三里穴”、“關(guān)元穴”進(jìn)行電針治療（同側(cè)“內(nèi)關(guān)穴”接同側(cè)“足三里穴”，在“關(guān)元穴”右側(cè)旁開0.5cm處再淺刺一針作為輔助電極）。電針治療接HANS

6、-200型電針儀，連續(xù)波，頻率2HZ，強(qiáng)度1mA，以大鼠肢體微微顫動為度，自造模開始，每天治療一次，每次10min，共持續(xù)21天。針刺結(jié)束后，采用 BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件檢測各組大鼠心率（HR）、ST段變化。采用HE染色法觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的變化。通過TTC染色法檢測大鼠心肌梗死面積。Tunel法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。采用電鏡觀察大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)變化。免疫組化發(fā)檢測大鼠心肌組織PI3K、Akt、Caspase3

7、、Caspase9、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。采用RT-PCR（Real time-PCR）檢測大鼠心肌組織PI3K、AktmRNA的表達(dá)水平，同時采用免疫印跡法（Westernblot）檢測PI3K、Akt蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.干預(yù)前各組之間 HR、ST段電壓兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），組間具有可比性。除正常組，其余各組干預(yù)后較干預(yù)前HR增快、ST段電壓抬高，差異均有極顯著

8、性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。干預(yù)后，與正常組比較，各組HR增快、ST段電壓抬高極為明顯（均P<0.01）。與模型組比較，IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組HR減慢、ST段電壓下降明顯（均P<0.01）；LY294002組HR增快（P<0.05），ST段電壓增高（P<0.01）；標(biāo)本配穴+LY294002組 HR、ST段電壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與標(biāo)本配穴組比，LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組HR、ST段電壓

9、高于標(biāo)本配穴組（均P<0.01）；IGF-1組與標(biāo)本配穴組比較，HR、ST段電壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；內(nèi)關(guān)組較標(biāo)本配穴組HR增快、ST段電壓抬高（P<0.05）。
　　2.光鏡下心肌組織HE染色可見,正常組心肌纖維緊湊，排列整齊，細(xì)胞核清晰可見，紅色為肌纖維，藍(lán)色為細(xì)胞核；模型組顯示心肌受損時心肌細(xì)胞肥大，肌漿凝聚，呈強(qiáng)嗜酸性染色（深紅），部分崩碎成不規(guī)則的粗顆?；驁F(tuán)塊，心肌纖維排列紊亂、扭曲、斷裂，肌纖維間隙增寬，局

10、部纖維化，細(xì)胞核破裂、溶解，分散混亂，壞死面積超過心臟厚度的1/2；LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組心肌損傷比模型組更重。經(jīng)電針治療后標(biāo)本配穴組和內(nèi)關(guān)組心肌損傷明顯減輕，且標(biāo)本配穴組改善程度優(yōu)于內(nèi)關(guān)組，與IGF-1組改善程度相一致。
　　3.與正常組相比，其他各組IS/LV和ARR/LV均明顯增高，差異有顯著性意義（P<0.05或 P<0.01）。與模型組相比，IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組的 IS/LV和 AR

11、R/LV均有所下降，差異有顯著性意義（P<0.01）；LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組的IS/LV和ARR/LV明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或<0.05）。與標(biāo)本配穴組比較，IGF組IS/LV和ARR/LV有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；內(nèi)關(guān)組、LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組的IS/LV和ARR/LV比值高于標(biāo)本配穴組，差異有顯著性意義（P<0.01）。
　　4.與正常組

12、相比，其他各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（Apoptotic Index，AI）均明顯增高，差異有顯著性意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組相比， IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組的 AI均有所下降，差異有顯著性意義（P<0.01）；LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組的AI明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或<0.05）。與標(biāo)本配穴組比較，IGF組AI有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；內(nèi)關(guān)組、LY29400

13、2組和標(biāo)本配穴+LY294002組的AI比值高于標(biāo)本配穴組，差異有顯著性意義（P<0.01）。
　　5.正常組心肌肌原纖維平行排列整齊，肌絲清晰；線粒體較豐富，形態(tài)一致，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)完整，嶺飽滿，無線粒體腫脹和空泡樣變性；線粒體嵴數(shù)目較多，呈板層狀形態(tài)，嵴突呈大致平行片層狀排列；細(xì)胞核和核仁顯示良好。模型組：心肌細(xì)胞損傷較重，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)水腫明顯，肌絲溶解，線粒體水腫、空泡變、灶性空化，嵴斷裂、紊亂并數(shù)目明顯減少，形成很寬的電子高透

14、亮區(qū)；基質(zhì)電子密度低、致密顆粒減少甚或消失，伴隨空泡樣區(qū)域形成；肌小節(jié)斷裂，肌原纖維排列紊亂，部分Z線不明顯；細(xì)胞核染色體固縮、邊聚，形成新月體形，可見到典型的早期凋亡小體。LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組線粒體損傷程度相似。經(jīng)電針治療后，標(biāo)本配穴組和內(nèi)關(guān)組心肌線粒體損傷程度改善，且標(biāo)本配穴組改善程度優(yōu)于內(nèi)關(guān)組，并與IGF-1組線粒體改善程度一致。
　　6.與正常組相比，各組大鼠心肌組織內(nèi)Caspase3、Casp

15、ase9和Bax蛋白表達(dá)均有不同程度升高，差異有顯著性意義（P<0.01），說明造模后心肌出現(xiàn)不同程度細(xì)胞凋亡，造模成功。與模型組相比，標(biāo)本配穴+LY294022組 Caspase3、Caspase9和 Bax蛋白表達(dá)與模型組相比無明顯差異（P>0.05）；LY294002組 Caspase3、Caspase9和 Bax蛋白表達(dá)更明顯（P<0.05），說明細(xì)胞凋亡程度更重；IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組的Caspase3、Caspas

16、e9和Bax蛋白表達(dá)較模型組不同程度下降（P<0.01或0.05），說明這三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度輕于模型組。與標(biāo)本配穴組比，內(nèi)關(guān)組、LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表達(dá)均不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01），說明標(biāo)本配穴組心肌細(xì)胞凋亡程度低于這三組；IGF-1組Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表達(dá)與標(biāo)本配穴組比較無明顯差異（P>0.05），

17、說明兩組心肌細(xì)胞凋亡程度幾乎一致。
　　7.與正常組相比，各組大鼠心肌組織內(nèi) Bcl-2蛋白表達(dá)均有不同程度升高，差異有顯著性意義（P<0.01）。與模型組相比，標(biāo)本配穴+LY294002組 Bcl-2蛋白表達(dá)稍高于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P>0.05）；LY294002組 Bcl-2蛋白表達(dá)低于模型組，差異顯著（P<0.01）；IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組的 Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組不同程度升高（P<0.01或0.0

18、5）。與標(biāo)本配穴組比，內(nèi)關(guān)組、LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組Bcl-2蛋白表達(dá)低于標(biāo)本配穴組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）；IGF-1組 Bcl-2蛋白表達(dá)與標(biāo)本配穴組比較無明顯差異（P>0.05）。
　　8.與正常組相比，各組PI3KmRNA表達(dá)均有增高明顯（P<0.05）。與模型組比，IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組PI3KmRNA表達(dá)量增加（P<0.01）， LY294002組PI3KmRNA

19、表達(dá)量低于模型組（P<0.01），標(biāo)本配穴+LY294002組PI3KmRNA表達(dá)量與模型組比較無差異（P>0.05）；與標(biāo)本配穴組相比， IGF-1組PI3K表達(dá)量無差異（P>0.05），內(nèi)關(guān)組PI3K表達(dá)量低于標(biāo)本配穴組（P<0.05），LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組PI3KmRNA表達(dá)量低于標(biāo)本配穴組（P<0.01）。
　　9.與正常組相比，模型組 AKT1mRNA和 Akt2mRNA表達(dá)升高（P<0.01

20、）， LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組AKT1mRNA、Akt2mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01或<0.05），IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組AKT1mRNA和Akt2mRNA表達(dá)量增加顯著（P<0.01）。與模型組比，IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組AKT1mRNA和Akt2mRNA表達(dá)量增加（P<0.01或<0.05），LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組AKT1mRNA、Akt2mRNA表達(dá)量低于模

21、型組（P<0.01）。與標(biāo)本配穴組相比， IGF-1組 AKT1mRNA和 Akt2mRNA表達(dá)量無差異（P>0.05），內(nèi)關(guān)組AKT1mRNA和Akt2mRNA表達(dá)量低于標(biāo)本配穴組（P<0.01或<0.05）。
　　10.與正常組相比，各組PI3K蛋白表達(dá)均有增高明顯（P<0.05）。與模型組比，IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組PI3K蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.01）， LY294002組PI3K蛋白表達(dá)量低于模型組（P<0.

22、01），標(biāo)本配穴+LY294002組PI3K蛋白表達(dá)量與模型組比較無差異（P>0.05）。與標(biāo)本配穴組相比， IGF-1組PI3K蛋白表達(dá)量無差異（P>0.05），內(nèi)關(guān)組、LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組PI3K蛋白表達(dá)低于標(biāo)本配穴組（P<0.01）。
　　11.對于Akt1和Akt2蛋白來說，LY294002組和標(biāo)本配穴+LY294002組的Akt1和Akt2蛋白明顯低于其它各組，差異有顯著性意義（P<0.01）

23、；而模型組、IGF-1組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)本配穴組的Akt1和Akt2蛋白較正常組均升高，差異顯著（P<0.01），其中以IGF-1組和標(biāo)本配穴組升高最為明顯。與標(biāo)本配穴組比，內(nèi)關(guān)組 Akt1和 Akt2蛋白表達(dá)程度降低，差異顯著（P<0.01），而 IGF-1的Akt1和 Akt2蛋白與標(biāo)本配穴組比無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.“標(biāo)本配穴”電針治療能有效改善慢性心肌缺血模型大鼠心率（HR）、ST段電壓變化，減

24、輕心肌病理損傷，降低缺血心肌梗死面積，恢復(fù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)與功能，改善心肌缺血狀態(tài)，在慢性心肌缺血大鼠治療中發(fā)揮了很好的心肌保護(hù)作用。
　　2.“標(biāo)本配穴”電針治療可降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，并可調(diào)節(jié)Caspase3、Caspase9、Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)，抑制促凋亡蛋白表達(dá)，在心肌細(xì)胞凋亡中起到抑制凋亡的作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。
　　3.與單取內(nèi)關(guān)穴治療相比，“標(biāo)本配穴”電針治療在上述各種指

25、標(biāo)的改善程度上更有優(yōu)勢，提示“標(biāo)本配穴”有腧穴協(xié)同作用，為腧穴配伍效應(yīng)提供有力證據(jù)。
　　4.通過在造模中加入PI3K/Akt通路特異性阻斷劑LY294002，導(dǎo)致心肌缺血模型大鼠HR、ST段電壓升高明顯，HE染色顯示心肌病理損傷、心肌線粒體結(jié)構(gòu)破壞、心肌缺血梗死面積比模型組更嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡指數(shù)更高，抑制凋亡的Akt1、Akt2mRNA和PI3K、Bcl-2、Akt1、Akt2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，促凋亡蛋白Caspase3、Cas