RNA編輯在肺腺癌中的臨床意義及作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.研究早期肺腺癌患者基因編碼區(qū)的RNA編輯現(xiàn)象。
　　2.研究腺苷脫氨酶1（Adenosine Deaminases that Act on RNA1，ADAR1）、腺苷脫氨酶2（Adenosine Deaminases that Act on RNA2，ADAR2）和鳥氨酸脫羧酶（Ornithine Decarboxylase，ODC）在肺腺癌中表達(dá)的臨床意義及預(yù)后價(jià)值。
　　3.研究抗酶蛋白抑制因子1

2、（Antizyme inhibitor1，AZIN1）的RNA編輯對(duì)A549細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法：
　　1.應(yīng)用微流控芯片多重聚合酶聯(lián)反應(yīng)與 RNA測(cè)序（ microfluidics-based multiplex PCR and RNA sequencing）檢測(cè)早期肺腺癌患者基因編碼區(qū)的RNA編輯現(xiàn)象。應(yīng)用熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織與癌旁正常組織中ADAR1、ADAR2和ODC的基因表

3、達(dá)水平。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)ADAR1、ADAR2和ODC蛋白在肺腺癌腫瘤組織與癌旁正常組織中的表達(dá)，分析ADAR1與ODC在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性和預(yù)后價(jià)值。
　　3.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)編輯型AZIN1基因的A549細(xì)胞（A549-edt/AZIN1）和穩(wěn)定表達(dá)野生型AZIN1基因的A549細(xì)胞（A549-wt/AZIN1）。應(yīng)用XTT實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，研究AZIN1的RNA編輯對(duì)于A549增

4、殖和侵襲的影響，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)ODC蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.相對(duì)于癌旁正常組織，肺腺癌組織的RNA編輯水平升高。在肺腺癌腫瘤組織編輯水平最高的20個(gè)基因中，在基因編碼區(qū)的共涉及14個(gè)基因位點(diǎn)，包括：COG3，SRP9，COPA，SRP9，CACNA1D，RICTOR，ZNF669，METTL6， FLNA，AZIN1，C20orf30，PODXL，F(xiàn)LNB，PDZD7。
　　2. ADAR1基因和 O

5、DC基因在肺腺癌腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，P＜0.05。ADAR2基因在肺腺癌腫瘤組織中的表達(dá)與癌旁正常組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中P＞0.05。
　　3. ADAR1蛋白定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒。60.4％的肺腺癌組織ADAR1高表達(dá)，而癌旁正常組織僅20.8%為高表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ADAR1蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯相關(guān)（P＜0.05）；而與性別、年齡、吸煙

6、史、胸膜侵犯情況、腫瘤最大直徑和分化程度無明顯相關(guān)（P＞0.05）。
　　4. ADAR2蛋白定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒。10.4%的肺腺癌組織ADAR2高表達(dá)，而癌旁正常組織中8.3%為高表達(dá)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5. ODC蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞漿呈棕黃色。56.3%的肺腺癌組織 ODC高表達(dá)，而癌旁正常組織僅12.5%為高表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ODC蛋白的表達(dá)與

7、肺腺癌患者的TNM分期明顯相關(guān)（P＜0.05）；而與性別、年齡、吸煙史、胸膜侵犯情況、腫瘤最大直徑、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)（P＞0.05）。
　　6.經(jīng)過秩相關(guān)性分析，肺腺癌患者中ADAR1與ODC的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.832， P＜0.01）。生存分析顯示ADAR1與ODC的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析顯示，ADAR1蛋白表達(dá)水平、TNM分期是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　7

8、.通過XTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試A549、A549-edt/AZIN1和A549-wt/AZIN1的增殖能力。第一天，三組細(xì)胞增殖未出現(xiàn)明顯的差異。第三天， A549-edt/AZIN1與A549-wt/AZIN1的增殖速度明顯高于 A549（ P＜0.05）。第六天， A549-edt/AZIN1的增殖速度明顯高于A549-wt/AZIN1（P＜0.05）。
　　8.通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，比較A549，A549-edt/AZI

9、N1和A549-wt/AZIN1穿透Matrigel Invasion Chamber的侵襲能力，結(jié)果顯示：A549-edt/AZIN1（477±68）穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于A549-wt/AZIN1（327±42）（P＜0.05），即A549-edt/AZIN1的侵襲能力比A549-wt/AZIN1的侵襲能力強(qiáng)。
　　9.通過Western blot檢測(cè)A549-edt/AZIN1和A549-wt/AZIN1中ODC的表達(dá)量

10、，發(fā)現(xiàn) A549-edt/AZIN1和 A549-wt/AZIN1中 ODC的蛋白表達(dá)量高于 A549（P＜0.05），且ODC在A549-edt/AZIN1的表達(dá)量高于A549-wt/AZIN1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1.相對(duì)于癌旁正常組織，肺腺癌組織的RNA編輯水平升高。在肺腺癌腫瘤組織編輯水平最高的20個(gè)基因中，在基因編碼區(qū)的共涉及14個(gè)基因位點(diǎn)，包括：COG3，SRP9，COPA，SRP

11、9，CACNA1D，RICTOR，ZNF669，METTL6， FLNA，AZIN1，C20orf30，PODXL，F(xiàn)LNB，PDZD7。
　　2.肺腺癌患者腫瘤組織中ADAR1與ODC的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，二者在肺腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)。肺腺癌患者腫瘤組織與癌旁正常組織中ADAR2的表達(dá)無明顯差異，主要為低表達(dá)。ADAR1蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯相關(guān)。ODC蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者的TNM分期明顯