NOV的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系增殖、凋亡和遷移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)人骨肉瘤細(xì)胞系中腎母細(xì)胞瘤過表達(dá)（ nephroblastoma overexpressed，NOV）基因的表達(dá)水平；采用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)或干擾技術(shù)探討NOV對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株143B和MG63增殖、凋亡和遷移等作用的影響，并對(duì)其作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法：⑴人骨肉瘤細(xì)胞系中NOV的表達(dá)水平檢測(cè)：以本實(shí)驗(yàn)室保存的4種人骨肉瘤細(xì)胞株（143B、U2OS、MG63和SaOS2）為研究對(duì)象，分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄

2、聚合酶鏈反應(yīng)（ reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)各細(xì)胞中NOV的表達(dá)水平，從而確定不同類型人骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)。⑵重組腺病毒的感染效率驗(yàn)證：攜帶人NOV過表達(dá)基因的重組腺病毒Ad-NOV及其空載體陰性對(duì)照Ad-GFP和表達(dá)針對(duì)人NOV的siRNA的重組腺病毒Ad-siNOV及其陰性對(duì)照Ad-RFP分別用于感染對(duì)應(yīng)的

3、低表達(dá)和高表達(dá)NOV的人骨肉瘤細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率，并通過RT-PCR和Western blot驗(yàn)證NOV在mRNA和蛋白水平的表達(dá)或干擾效果。⑶NOV的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤143B和MG63細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響：143B和MG63細(xì)胞經(jīng)病毒處理相應(yīng)時(shí)間后，采用MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變；Hochest33258染色和FCM用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平；通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transw

4、ell小室法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。此外，進(jìn)一步采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax以及與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinase， MMP）家族的表達(dá)變化，以反映細(xì)胞的凋亡和遷移能力改變。⑷NOV的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤143B和MG63細(xì)胞中信號(hào)通路的影響：病毒處理143B和MG63細(xì)胞48 h后，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)

5、整合素受體家族的表達(dá)；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)異?；罨男盘?hào)分子，Western blot檢測(cè)PI3K/Akt、MAPK及下游AP-1等相關(guān)蛋白的磷酸化水平，從而明確NOV作用于人骨肉瘤細(xì)胞的信號(hào)通路。⑸MAPK信號(hào)通路在NOV誘導(dǎo)的骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中的作用：應(yīng)用MAPK/p38的抑制劑SB203580和MAPK/JNK的抑制劑SP600125分別處理143B細(xì)胞，Western blot檢測(cè)p-p38和p-JNK的表達(dá)水

6、平，驗(yàn)證抑制劑的效率；細(xì)胞經(jīng)抑制劑處理相應(yīng)時(shí)間后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，并通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：①4株骨肉瘤細(xì)胞株經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后結(jié)果顯示，NOV的表達(dá)存在明顯的差異，其中在143B細(xì)胞中的表達(dá)水平最低，在SaOS2和U2OS細(xì)胞中有一定程度的表達(dá)，而在MG63細(xì)胞中表達(dá)水平為最高。Western blot

7、結(jié)果得到的NOV蛋白表達(dá)水平與mRNA結(jié)論基本一致。②143B和MG63細(xì)胞經(jīng)相對(duì)應(yīng)的腺病毒感染24-36 h后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞中綠色和紅色熒光蛋白表達(dá)有所增強(qiáng)，鏡下判斷腺病毒在細(xì)胞中的感染效率達(dá)到60-70％。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示143B細(xì)胞中Ad-NOV組的NOV的表達(dá)明顯高于Ad-GFP組(p＜0.01)和空白對(duì)照組(p＜0.05)；MG63細(xì)胞中Ad-siNOV組的NOV灰度值則顯著低于Ad-RF

8、P組和空白對(duì)照組(p＜0.05)。結(jié)果提示NOV在mRNA和蛋白水平均被成功過表達(dá)或干擾。③增殖能力相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示，143B細(xì)胞中Ad-NOV組的細(xì)胞增殖能力在48 h受到了抑制(p＜0.05)，并且該抑制作用在72 h表現(xiàn)的更為顯著(p＜0.01)；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦有類似的發(fā)現(xiàn)，Ad-NOV組的細(xì)胞克隆形成能力比對(duì)照組降低了23%(p＜0.01)；FCM結(jié)果證實(shí)NOV的過表達(dá)導(dǎo)致了143B細(xì)胞的周期阻滯。與之相反，在MG63細(xì)胞中

9、，一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-siNOV組中細(xì)胞的增殖能力(p＜0.01)，克隆形成能力(p＜0.05)都有所增強(qiáng)，對(duì)于細(xì)胞周期也有一定程度的促進(jìn)。凋亡水平相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示，143B細(xì)胞經(jīng)Ad-NOV處理48 h后發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞所占比例顯著高于Ad-GFP對(duì)照組(p＜0.01)，細(xì)胞核染色質(zhì)經(jīng) hochest33258染色也表現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象。同時(shí)， RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示Ad-NOV組細(xì)胞促凋亡因子Bax表達(dá)

10、上調(diào)(p＜0.01)，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)下降(p＜0.05)。反之在MG63細(xì)胞中，經(jīng)Ad-siNOV處理后發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目減少(p＜0.05)，細(xì)胞核染色質(zhì)的聚集程度減弱，Bax和Bcl-2的表達(dá)水平也表現(xiàn)出與143B細(xì)胞中相反的現(xiàn)象。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell分析顯示，Ad-NOV感染后的143B細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞的穿膜數(shù)目相對(duì)于對(duì)照組有所上升；RT-RCR結(jié)果進(jìn)一步顯示遷移促進(jìn)因子MMP蛋白家族的表達(dá)在Ad-NO

11、V組細(xì)胞中增強(qiáng)。而Ad-siNOV感染后MG63細(xì)胞的表現(xiàn)與上述內(nèi)容恰恰相反。④RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在Ad-NOV感染的143B細(xì)胞中，整合素受體αv和β3的mRNA和蛋白表達(dá)水平都有上調(diào)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞中AP-1和NF-κB信號(hào)分子異?；罨?。此外，p38和JNK的磷酸化水平在Ad-NOV組細(xì)胞中均有明顯上調(diào)，而p-Akt則無改變。在Ad-siNOV感染的MG63細(xì)胞中，無論是整合素受體還是

12、信號(hào)分子的磷酸化水平都表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。⑤使用MAPK/p38的抑制劑SB203580和MAPK/JNK的抑制劑SP600125分別處理143B細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞中p-p38和p-JNK的表達(dá)水平相比Ad-NOV組均有下調(diào)，提示SB203580和SP600125有效抑制了143B細(xì)胞中由于 NOV過表達(dá)而激活的MAPK/p38和MAPK/JNK信號(hào)通路。MTT結(jié)果顯示經(jīng)抑制劑作用后的143B細(xì)胞增殖能力減弱，低于

13、未經(jīng)抑制劑作用的Ad-NOV組；Transwell分析提示SB203580和SP600125能夠部分抑制NOV過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。Western blot結(jié)果顯示使用抑制劑后，Ad-NOV組細(xì)胞中Bax表達(dá)的上調(diào)趨勢(shì)被削弱，而Bcl-2的表達(dá)則有所恢復(fù)，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡水平被抑制。
　　結(jié)論：⑴4種人骨肉瘤細(xì)胞株中NOV的表達(dá)水平存在明顯的差異。⑵NOV的過表達(dá)能夠抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，而在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和遷移