沉默ZFX對人骨肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響.pdf

1、目的:
　　明確骨肉瘤細(xì)胞及組織中ZFX基因的高表達(dá)與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性,構(gòu)建ZFX基因siRNA慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染骨肉瘤Saos-2、MG-63細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞的ZFX的表達(dá)水平。通過下調(diào)ZFX基因在骨肉瘤Saos2、MG-63細(xì)胞中的表達(dá),觀察其對骨肉瘤Saos2、MG-63細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。闡明其在骨肉瘤中的功能作用。
　　方法:
　　選取四種骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS,Saos-2,MG-63和SW

2、1353,及選取47例手術(shù)時病理檢查證實為骨肉瘤的組織標(biāo)本,人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞作為ZFX表達(dá)的陽性對照,通過Western blot檢測四種骨肉瘤細(xì)胞及47例骨肉瘤組織標(biāo)本中的ZFX的表達(dá)水平。并分析ZFX表達(dá)與骨肉瘤發(fā)生的相關(guān)性。
　　根據(jù)文獻(xiàn)報道的ZFX基因shRNA序列進(jìn)行合成,并構(gòu)建ZFX-siRNA慢病毒載體,經(jīng)DNA測序確認(rèn)構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染骨肉瘤Saos2、MG-63細(xì)胞。采用Real time-PCR檢測病毒轉(zhuǎn)染后

3、Saos-2及MG-63的ZFX表達(dá)水平。
　　最后采用Transwell實驗分別觀察轉(zhuǎn)染siRNA-ZFX慢病毒載體的Saos2、MG-63細(xì)胞(Lv-shZFX)、空白對照(Con)、轉(zhuǎn)染含無義序列的慢病毒載體(Lv-shCon)三組細(xì)胞的侵襲及遷移能力變化,其中轉(zhuǎn)染含無義序列的慢病毒載體(Lv-shCon)為陰性對照。細(xì)胞計數(shù)使用25μL流式細(xì)胞儀分析。運(yùn)動實驗使用Transwell細(xì)胞運(yùn)動試劑盒。
　　結(jié)果:

4、　　ZFX在四種骨肉瘤細(xì)胞系均有表達(dá)。與U2OS細(xì)胞株相比,三種細(xì)胞系(MG63, Saos2和SW1353)表達(dá)了高水平的ZFX。ZFX在51.1％(24/47)的骨肉瘤患者組織標(biāo)本中高表達(dá)。而且,骨肉瘤組織中ZFX的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。
　　經(jīng)DNA測序鑒定確認(rèn)慢病毒載體構(gòu)建成功后,分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2及MG-63,質(zhì)粒攜帶有GFP綠色熒光蛋白基因,熒光顯微鏡下,轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可見綠色熒光。鏡下觀

5、察可見GFP表達(dá)在超過90％的細(xì)胞中可被觀察到,證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　通過Real-time PCR驗證ZFX基因沉默效率。結(jié)果顯示,siRNA-ZFX(Lv-shZFX)組細(xì)胞中ZFX基因在mRNA水平較CON及Lv-shCon組明顯下降(P<0.05)。而CON與Lv-shCon兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。證實了shRNA慢病毒對ZFX基因具有顯著的沉默效率。
　　Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示siRN