父親應(yīng)激對子代糖代謝的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　當(dāng)今社會，隨著經(jīng)濟水平的發(fā)展，生活方式的轉(zhuǎn)型，焦慮、緊張、抑郁等心理壓力與應(yīng)激日益頻繁，已嚴(yán)重危害人類健康。大量人群流行病學(xué)研究表明，心理應(yīng)激(Psychological stress)與多個疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤、2型糖尿病等。此外，近年來的研究表明，母親的心理應(yīng)激，尤其是妊娠期間的應(yīng)激，可導(dǎo)致子代肥胖和高血糖的發(fā)生。但父親的心理應(yīng)激，能否影響或調(diào)控子代的糖代謝情況，目前尚無文獻(xiàn)報

2、道。因此，本研究利用C57BL/6小鼠模型，試圖探討父親應(yīng)激對子代糖代謝的調(diào)控作用及分子機制。
　　方法：
　　1.父親應(yīng)激模型的建立：將8周齡C57BL/6雄性小鼠置于50 ml離心管中(Restraint stress)，每天2小時，持續(xù)2周(Stress-F0)。對照組小鼠(Control-F0)在此期間，自由攝食、飲水與活動。2周后，將兩組小鼠分別與正常 C57BL/6雌鼠交配。48小時后，留取雌鼠單籠飼養(yǎng)，以排除雄

3、鼠影響，進(jìn)而獲得子代小鼠(Control-F1，Stress-F1)。
　　2.子代糖代謝指標(biāo)檢測：分別檢測兩組子代小鼠的血糖水平，并進(jìn)行葡萄糖、胰島素、丙酮酸耐量實驗，同時監(jiān)測小鼠的體重、進(jìn)食量、氧耗、活動度、血壓等其他代謝指標(biāo)。
　　3.子代糖代謝基因表達(dá)檢測：通過實時定量PCR(Q-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)實驗，檢測兩組小鼠糖異生關(guān)鍵酶(PEPCK、G6Pase)的表達(dá)水平。
　　4.分

4、子機制研究：
　　a：對兩組小鼠的肝臟進(jìn)行MicroRNA表達(dá)譜芯片分析，以期篩選出對肝臟糖異生基因特異性調(diào)控的MicroRNA，進(jìn)而驗證MicroRNA的調(diào)控作用；
　　b：檢測兩組小鼠MicroRNA啟動子區(qū)的甲基化水平，進(jìn)一步檢測父代小鼠精子該MicroRNA啟動子區(qū)的甲基化水平；
　　c：體外受精-胚胎移植(IVF-ET)：為了排除母親的影響，我們將來自同一供體雌鼠的卵子分別與兩組父代小鼠的精子共培養(yǎng)，獲得的兩

5、組胚胎分別移植入同一受體雌鼠的兩側(cè)子宮，并檢測E16.5天胎肝靶基因的啟動子甲基化水平；
　　d：檢測啟動子區(qū)域甲基化改變對關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及組蛋白修飾的影響，以期明確DNA甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)變化的內(nèi)在機制。
　　5.探討糖皮質(zhì)激素在父親應(yīng)激導(dǎo)致子代糖代謝改變中的作用：
　　a：給予應(yīng)激小鼠糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑-RU486處理，檢測父親精子甲基化改變、子代小鼠糖代謝表型；
　　b：給予雄性小鼠糖皮質(zhì)激素類似物-

6、地塞米松處理，探討父親精子甲基化改變、子代小鼠糖代謝表型。
　　結(jié)果：
　　1.與Control-F1小鼠相比，Stress-F1小鼠表現(xiàn)為血糖升高，丙酮酸耐量實驗表明肝臟糖異生和肝糖輸出能力增強，而葡萄糖和胰島素耐量實驗表明胰島素敏感性未受影響。此外，兩組小鼠其他代謝指標(biāo)均無明顯改變。
　　2.Stress-F1小鼠肝臟PEPCK的蛋白水平顯著增加，而mRNA無明顯改變，提示PEPCK的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，

7、而另一糖異生關(guān)鍵酶–G6Pase的mRNA和蛋白水平均無改變。
　　3.MicroRNA表達(dá)譜芯片結(jié)合Q-PCR驗證，篩選出調(diào)節(jié)PEPCK表達(dá)的一個MicroRNA，即：miR-466b-3p的表達(dá)在Stress-F1小鼠肝臟中顯著下調(diào)。
　　4.熒光素酶報告基因等體內(nèi)外實驗證實：miR-466b-3p可結(jié)合在PEPCK基因3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)，抑制 PEPCK的蛋白表達(dá)，從而調(diào)控葡萄糖產(chǎn)生能力。
　　5.S

8、tress-F1組小鼠肝臟及父代小鼠精子中miR-466b-3p啟動子區(qū)甲基化程度增強，從而下調(diào)其表達(dá)。
　　6.IVF-ET結(jié)果表明E16.5天胎鼠肝臟miR-466b-3p啟動子區(qū)甲基化增強，從而排除了母親的可能影響。
　　7.miR-466b-3p啟動子區(qū)甲基化程度增強，導(dǎo)致關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NRF2結(jié)合能力銳減以及抑制性的組蛋白修飾(H3K9和H3K27)富集，最終導(dǎo)致 miR-466b-3p的表達(dá)降低。
　　8.給

9、予糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑-RU486可以逆轉(zhuǎn)應(yīng)激所致的精子甲基化改變和子代糖代謝異常。
　　9.地塞米松可模擬應(yīng)激所致的精子甲基化改變和子代糖代謝異常。
　　結(jié)論：
　　父代小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)時，糖皮質(zhì)激素水平激增，導(dǎo)致精子中miR-466b-3p啟動子區(qū)域的甲基化程度增強，并遺傳至子代小鼠肝臟，下調(diào)該miRNA的表達(dá)，從而上調(diào)PEPCK的蛋白水平，促進(jìn)肝臟糖異生和肝糖輸出，導(dǎo)致子代小鼠高血糖的發(fā)生。因此，通過本研究的深入