DOCK5參與糖代謝調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 DOCK5-/-小鼠的引進(jìn)、繁育及子代基因型鑒定
　　目的：獲取DOCK5敲除模型小鼠并順利繁殖和鑒定，為深入研究DOCK5基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：聯(lián)系加大拿蒙特利爾臨床研究所（IRCM）細(xì)胞骨架的組織和細(xì)胞遷移研究室并同意惠贈(zèng)DOCK5敲除模型小鼠，委托國內(nèi)專業(yè)科研單位代理小鼠的進(jìn)口事務(wù)并將小鼠運(yùn)輸至本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)和繁殖，并觀察小鼠繁殖情況及表型變化。根據(jù)孟德爾遺傳定律進(jìn)行繁殖得到不同基因型的子代

2、小鼠，利用PCR技術(shù)對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因型鑒定。
　　結(jié)果：引進(jìn)DOCK5+/-小鼠6只，小鼠繁殖及生育順利，符合孟德爾遺傳定律。探索得到適宜的DOCK5鑒定PCR擴(kuò)增條件，順利進(jìn)行DOCK5敲除小鼠的基因型鑒定。
　　結(jié)論：DOCK5敲除小鼠引進(jìn)、飼養(yǎng)及繁殖順利，成功建立敲除鼠的鑒定PCR技術(shù)，能夠得到來源穩(wěn)定的動(dòng)物模型，可用于后續(xù)的相關(guān)研究。
　　第二部分 DOCK5對(duì)糖代謝影響的體內(nèi)研究
　　目的：探討高脂飲

3、食誘導(dǎo)下DOCK5敲除對(duì)小鼠胰島素抵抗及糖代謝的影響。
　　方法：以C57BL/6J背景的DOCK5+/+小鼠和DOCK5-/-小鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為4組：DOCK5+/+小鼠普通飼料喂養(yǎng)組(SD-DOCK5+/+組, n=30)、DOCK5+/+小鼠高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD-DOCK5+/+組, n=30)、DOCK5-/-小鼠普通飼料喂養(yǎng)組(SD-DOCK5-/-組, n=30)、DOCK5-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD-D

4、OCK5-/-組, n=30)。利用高脂飲食和基因敲出構(gòu)建環(huán)境與遺傳雙重因素作用的動(dòng)物模型，觀察各組小鼠體重、攝食、呼吸商和能量消耗的變化，測定其血糖、胰島素和血脂等生化指標(biāo)，行葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐量試驗(yàn)、丙酮酸耐量試驗(yàn)以及高胰島素正糖鉗夾和組織糖攝取等實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)機(jī)體總體代謝情況、葡萄糖代謝以及胰島素敏感性的變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建遺傳與環(huán)境因素相互作用的動(dòng)物模型。與SD-DOCK5+/+組小鼠相比，SD-DOCK5-/-組

5、小鼠各個(gè)指標(biāo)沒有顯著性變化（P＞0.05）；HFD-DOCK5+/+組小鼠各個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)出高脂飲食誘導(dǎo)后出現(xiàn)的相應(yīng)變化。與 HFD-DOCK5+/+組小鼠相比，HFD-DOCK5-/-組小鼠體重、肝重、附睪脂肪重量顯著增高（P＜0.05）；攝食增加，而呼吸商及能量消耗顯著下降（P＜0.01）；基礎(chǔ)態(tài)血糖、胰島素、血脂水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。GTT、ITT和PTT結(jié)果顯示HFD-DOCK5-/-組小鼠在負(fù)荷狀態(tài)下血糖或胰

6、島素水平均顯著高于 HFD-DOCK5+/+組小鼠（P＜0.01或P＜0.05）。鉗夾穩(wěn)態(tài)時(shí)HFD-DOCK5-/-組小鼠GIR和GRd顯著低于HFD-DOCK5+/+組小鼠（P＜0.01或P＜0.05），HGP顯著增高， HGP抑制率顯著下降（ P＜0.05）。組織糖攝取的結(jié)果顯示， HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟和附睪脂肪的組織糖攝取顯著低于HFD-DOCK5+/+組小鼠（P＜0.01），但是兩組小鼠間骨骼肌肉組織的糖攝取沒有變

7、化。
　　結(jié)論：高脂飲食誘導(dǎo)下DOCK5敲除可導(dǎo)致小鼠胰島素抵抗和葡萄糖代謝障礙，與2型糖尿病的發(fā)生存在密切的聯(lián)系。
　　第三部分DOCK5調(diào)控肝臟糖代謝的分子機(jī)制研究
　　目的：觀察DOCK5敲除或抑制表達(dá)對(duì)肝臟PI3K-Akt途徑及相關(guān)糖代謝關(guān)鍵信號(hào)分子的影響，探討DOCK5參與胰島素抵抗及葡萄糖代謝紊亂的分子機(jī)制。
　　方法：利用QPCR技術(shù)分析C57BL/6J小鼠DOCK5 mRNA的組織表達(dá)分布。檢測S

8、D-DOCK5+/+組和HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟、肌肉、脂肪DOCK5mRNA和蛋白表達(dá)變化。在各組小鼠肝臟組織中檢測IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和PP2A蛋白表達(dá)或活性變化。利用DOCK5-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6肝細(xì)胞構(gòu)建DOCK5抑制表達(dá)的細(xì)胞模型，并在胰島素刺激和/或PP2A抑制劑OKadaic acid處理的情況下檢測細(xì)胞的葡萄糖攝取率變化，分析DOCK5抑制表達(dá)對(duì) IR、IR

9、S1、Akt、GSK3β、PEPCK和G6Pase蛋白的表達(dá)及活性變化，并分析OKadaic acid對(duì)上述相關(guān)指標(biāo)的影響。
　　結(jié)果：C57BL/6J小鼠DOCK5 mRNA在體內(nèi)多種組織均有表達(dá)，肝臟的表達(dá)量高于脂肪和肌肉組織。DOCK5 mRNA和蛋白在HFD-DOCK5+/+組小鼠肝臟的表達(dá)量顯著高于SD-DOCK5+/+組小鼠（P＜0.01），組間肌肉和脂肪組織的差異表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與SD-DOCK5+/+組小鼠相比

10、，SD-DOCK5-/-組小鼠肝臟 IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和 PP2A蛋白表達(dá)或活性變化沒有差異（P＞0.05）；HFD-DOCK5+/+組小鼠肝臟各個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)出高脂飲食誘導(dǎo)后的相應(yīng)變化（P＜0.05）。與 HFD-DOCK5+/+組小鼠相比，HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟IR和IRS1蛋白磷酸化水平?jīng)]有差異，Akt、GSK3β和PP2A蛋白磷酸化水平顯著下降（P＜0.05），而PEPCK和G6

11、Pase蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。Hepa1-6肝細(xì)胞模型中DOCK5抑制表達(dá)可顯著降低胰島素刺激的細(xì)胞葡萄糖攝?。≒＜0.01），PP2A抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。DOCK5抑制表達(dá)可顯著降低PP2A蛋白磷酸化水平（P＜0.01），但不影響IR和IRS1蛋白磷酸化水平。DOCK5抑制表達(dá)可降低Hepa1-6肝細(xì)胞胰島素刺激引起的Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平（P＜0.05），顯著增加PEPCK和G6Pase蛋白表達(dá)量（P＜0.01