孕期慢性應激對子代學習記憶能力影響及其干預的實驗研究.pdf

1、目的：通過建立孕期慢性不可預知溫和應激大鼠(Chronicunpredictablemild stress, CUMS)模型，在行為學、組織學、分子基因不同水平下，系統(tǒng)的觀察大鼠孕期處于應激狀態(tài)對母體生殖功能及母體、子代的學習記憶能力、情緒的影響，且從海馬神經遞質和可塑性出發(fā)，探討損傷的可能機制，并經過豐富環(huán)境來進行學習記憶能力損傷干預的機制探討，為深入理解和預測應激的遺傳性危害及下一步人群流行病學研究及干預提供科學依據。
　　方

2、法：選用Wistar雌性成年大鼠20只，隨機分為模型組和對照組，模型組連續(xù)21天采用單籠飼養(yǎng)和慢性輕度不可預知應激造模(在第3天開始交配)；1)動態(tài)觀察母鼠體重變化，采用放射免疫法測定血漿皮質酮水平，敞箱實驗測定行為學改變，糖水消耗實驗測定液體消耗，檢測生殖有關的基本情況；測定子鼠血漿皮質酮濃度，采用Morris水迷宮、Y迷宮實驗測定子鼠學習記憶能力，利用液體消耗實驗、敞箱實驗、懸尾實驗測定子鼠情緒變化的測定，并分析其變化；2)采用HE

3、染色和電鏡進行子鼠腦海馬形態(tài)學觀察，ELISA方法測定腦海馬組織各類中樞神經遞質含量及活性，分別采用實時熒光定量RT-PCR和Western Blotting測定海馬組織中神經營養(yǎng)因子 BDNF、IGF-Ⅱ、核轉錄因子 NF-κB，海馬中突觸可塑性相關蛋白Arc表達情況，并分析其相關性；3)給予孕期慢性應激及對照組子代組分別豐富環(huán)境干預，進行行為學、情緒、腦海馬神經遞質含量及突觸相關蛋白表達情況測定，分析其效果。
　　結果：1)模

4、型組母鼠體重與對照組存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型組大鼠體重增高率低于對照組；模型組母鼠皮質酮與對照組存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型組母鼠皮質酮水平隨應激時間增長有大幅度變化；除糞便粒數外，模型組母鼠行為學各指標與對照組存在統(tǒng)計學差異(P均<0.05)，母鼠各行為學指標變化與應激時間長短有關系，時間與應激因素之間不存在交互關系(P均>0.05)；模型組母鼠純水消耗與對照組未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學差異，而兩組糖水消耗、總液體消耗和1％

5、蔗糖偏愛存在統(tǒng)計學差異(P均<0.05)，表明應激對孕期大鼠液體消耗指標有影響；時間因素有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，母鼠液體消耗變化與應激時間長短有關系；每個時間點的比較：正常對照組和模型組的基線總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛百分比差異不大，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。應激第7、14天和21天，模型組大鼠液體消耗各指標與對照組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組所產子鼠只數及孕天數與對照組差異存在統(tǒng)計學意義(P<

6、0.05)，模型子鼠組只數及孕天數均低于對照子鼠組；2)在PND28和PND42時，模型子鼠組體重與對照子鼠組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型子鼠組血漿皮質酮與對照子鼠組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Morris水迷宮實驗：模型子鼠組在水迷宮中逃避潛伏期與對照子鼠組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，時間因素有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，時間與應激因素之間不存在交互關系(P>0.05)，模型子鼠組逃避潛伏期時間比對照子

7、鼠組長，且有隨時間縮短的趨勢；跨平臺次數兩組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；Y迷宮實驗：模型子鼠組在 Y迷宮試驗中學會所需的訓練次數、記憶保持測試正確反應率與對照子鼠組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；行為學實驗：除清潔次數外，模型子鼠組行為學各指標與對照子鼠組存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；液體消耗情況：模型子鼠組與對照子鼠組在液體消耗實驗中糖水消耗和1%蔗糖偏愛百分比存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而在純水消耗和總液體消耗方

8、面未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。懸尾實驗：模型子鼠組與對照子鼠組在懸尾實驗中靜止時間和掙扎次數均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；3)子鼠腦海馬形態(tài)結構改變，超微結構異常；模型子鼠組與對照子鼠組海馬膽堿能神經遞質ACh含量、ChAT和AChE活性均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型子鼠組ACh含量、ChAT活性下降，AChE活性上升；模型子鼠組與對照子鼠組海馬單胺類神經遞質NE、DA和5-HT均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模

9、型子鼠組三個單胺類神經遞質均下降；模型子鼠組與對照子鼠組海馬的Glu和GABA均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型子鼠組較對照子鼠組興奮性神經遞質 Glu降低、而抑制性GABA含量升高；模型子鼠組與對照子鼠組海馬的NO存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型子鼠組NO含量降低；4) RT-PCR提示：模型子鼠組與對照子鼠組海馬組織的BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA差異均存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型子鼠組

10、BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA表達降低，Arc mRNA差異未發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)：模型子鼠組與對照子鼠組海馬組織的BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B蛋白表達差異均存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與對照子鼠組相比，模型子鼠組BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B表達降低；5)相關性分析發(fā)現(xiàn)：子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓練次數與母鼠皮

11、質酮存在正相關(P<0.05)、與母鼠水平運動、垂直運動和1%蔗糖偏愛存在負相關(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的跨平臺次數和Y迷宮中的正確反應率與母鼠皮質酮存在負相關(P<0.05)，與水平運動、垂直運動和1%蔗糖偏愛存在負相關(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓練次數與子鼠皮質酮、海馬中GABA存在正相關(P<0.05)、與子鼠ACh、ChAT、NE、DA、5-HT和NO存在負相關(P<0.05)；子鼠在水迷宮

12、中的跨平臺次數和Y迷宮中的正確反應率與子鼠皮質酮、海馬中GABA存在負相關(P<0.05)、與子鼠ACh、ChAT、NE、DA、5-HT和NO存在正相關(P<0.05)；除水迷宮中的跨平臺次數和Y迷宮中訓練次數與IGF-Ⅱ蛋白表達未發(fā)現(xiàn)存在相關外(P>0.05)，其他指標均發(fā)現(xiàn)存在相關性：子鼠在水迷宮中的逃避潛伏期和Y迷宮中的訓練次數均與突觸各相關蛋白存在負相關性(P<0.05)；子鼠在水迷宮中的跨平臺次數和Y迷宮中的正確反應率與突觸各

13、相關蛋白存在負相關性(P<0.05)；6)豐富環(huán)境對子鼠體重的影響：模型子鼠組和模型&豐富環(huán)境組體重低于對照和對照&豐富環(huán)境組子鼠體重。經歷了豐富環(huán)境后，四組體重存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)；豐富環(huán)境對子鼠血漿皮質酮水平影響：四組血漿皮質酮同樣存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，模型子鼠組分別與其他各組差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照&豐富環(huán)境組子鼠血漿皮質酮最低，而模型子鼠組是最高的；7)豐富環(huán)境下子鼠學習記憶能力變化：四組在M

14、orris水迷宮中逃避潛伏期與對照子鼠組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩豐富環(huán)境組逃避潛伏期增長，跨平臺次數四組間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，對照&豐富環(huán)境組子鼠跨平臺次數最多，而模型子鼠組是最少；四組子鼠在Y迷宮試驗中學習、記憶次數比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進行豐富環(huán)境，學習、記憶能力就會有所提高；四組子鼠在水平運動和垂直運動方面比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，進行豐富環(huán)境，水平運動和垂直運動能力就會有

15、所提高；四組子鼠在純水消耗、糖水消耗和1%蔗糖偏愛百分比比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進行豐富環(huán)境，糖水消耗就會有所增加；四組在靜止時間和掙扎次數上比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，模型子鼠組水平靜止時間最長、掙扎次數最少，而模型子鼠組只要進行了豐富環(huán)境，靜止時間就會縮短、掙扎次數增多；8)豐富環(huán)境對各組子鼠神經遞質影響：四組子鼠在海馬組織膽堿能神經遞質 ACh含量、ChAT和AChE活性，單胺類神經遞質NE、DA和5-

16、HT含量及氨基酸類神經遞質Glu和GABA含量均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，豐富環(huán)境對其均有影響；四組子鼠在海馬組織NO含量方面均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，豐富環(huán)境后，NO含量升高；9)豐富環(huán)境對蛋白表達影響：四組子鼠海馬組織的BDNF mRNA、IGF-ⅡmRNA和NF-?B mRNA及蛋白表達差異均存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，經過豐富環(huán)境后，蛋白表達增高。
　　結論：1)孕期應激可誘發(fā)實驗母鼠行為、活動習性和生育

17、能力有影響；2)孕期慢性應激致子鼠出現(xiàn)高應激狀態(tài)，空間、工作學習記憶能力下降，情緒出現(xiàn)類似焦慮、抑郁現(xiàn)象；3)孕期慢性應激影響子鼠學習記憶能力下降與母體及子代血漿中皮質酮升高均有關；4)孕期慢性應激對子鼠學習記憶能力下降與海馬組織中樞神經遞質變化及BDNF、IGF-Ⅱ、Arc和NF-?B蛋白表達降低有關；5)豐富環(huán)境能改善子鼠的學習記憶能力，使大鼠的活動度增高、對新環(huán)境的探究行為和適應能力增高、大鼠快感也有所增加；6)豐富環(huán)境提高孕期慢