基于TthMutS的突變檢測技術和突變基因的功能分析.pdf

1、本文改進了一種可以利用錯配修復蛋白TthMutS直接從細菌基因組中檢測出未知突變的方法。利用這個方法，我們檢測了一株具有氯霉素高水平抗性表型的銅綠假單胞菌突變株中存在的突變，表明氯霉素乙?；D移酶catB7基因中181位和314位的A/G轉換使該菌株呈現(xiàn)了高水平氯霉素抗性。對氯霉素乙?；D移酶CATB7蛋白突變體的進一步研究表明，突變體比活性未見提高，但增加了它在細胞內的累積量，初步揭示了該銅綠假單胞菌突變株對氯霉素抗性水平提高的分子基

2、礎。 考慮到錯配修復蛋白MutS是DNA錯配修復系統(tǒng)中最關鍵的起識別和結合錯配的作用的一個蛋白，近年來開發(fā)出一系列基于大腸桿菌MutS蛋白的突變檢測方法。然而，這些方法大多是設計用來檢測合成的寡核苷酸片段或者PCR擴增片段中的已知突變，這就大大限制了這些方法的實用性。此外，體外試驗表明，大腸桿菌MutS蛋白并不能有效區(qū)分所有錯配類型。而來源于嗜熱微生物Thermusthermophilus的錯配修復蛋白TthMutS，能在高達6

3、0℃的溫度范圍內有效識別所有8種類型的堿基錯配和1到3個堿基的缺失或者插入引起的錯配，因而在突變檢測中有更大的潛力。 我們介紹了一種可以利用TthMutS直接從細菌基因組中檢測出未知突變的方法。野生型的基因組DNA和突變型的基因組DNA混合在一起，經(jīng)限制性內切酶消化后變性再復性，所產(chǎn)生的含有錯配堿基的異源雙鏈DNA片段用TthMutS來結合，并經(jīng)Ni-NTAHis-Bind()樹脂親和層析來回收。回收的DNA片段克隆到載體中，形

4、成一個含有錯配片段的微型文庫。進一步的DNA測序和遺傳互補實驗證實了該方法在從細菌的基因DNA中檢測未知突變是有效的。利用這個方法，我們檢測了一株具有氯霉素高水平抗性的銅綠假單胞菌突變株中存在的突變，表明氯霉素乙?；D移酶catB7基因中181位和314位的A/G轉換使該菌株呈現(xiàn)了高水平氯霉素抗性。同以前同類方法相比，該方法能夠比較容易地在基因組范圍內檢測未知突變，傳統(tǒng)的依賴于PCR擴增、凝膠電泳或構象變化的突變檢測方法是不適用這個目的

5、的。傳統(tǒng)的細菌遺傳學產(chǎn)生了大量表型已知而基因型未知的突變菌株，本文發(fā)展的方法在鑒定這些突變菌株的基因型方面將發(fā)揮很大的作用。 氯霉素乙?；D移酶基因cat在大多數(shù)革蘭氏陰性菌和陽性菌中都存在，CAT蛋白通過乙?；饔檬Щ盥让顾兀@是細菌抗抗生素機制中了解得最為清楚的一種途徑。我們在一株具有高水平氯霉素抗性表型的銅綠假單胞菌中，檢測到catB7基因存在了兩個點突變，181A/G和314A/G，它們分別引起G61S和Y105C氨基酸

6、替換，并且證實了catB7突變基因是菌株高水平氯霉素抗性表型的主要決定子。我們進一步從體外表達測活和體內遺傳互補幾方面來鑒定這個突變基因的性質，以期揭示這個抗性表型的分子基礎。 從野生型和突變型銅綠假單胞菌中分別擴增catB7基因，克隆到表達質粒pET28a中，形成表達質粒pETPaCATw和pETPaCATm，并利用定點突變獲得表達質粒pETPaCATm181和pETPaCATm314。采用IPTG誘導表達、變性純化和復性獲得

7、野生型和突變體氯霉素乙酰轉移酶重組蛋白CATB7、CATB7G61S,Y105C、CATB7G61S和CATB7Y105C。活性測定表明這四個重組蛋白的比活性和動力學參數(shù)非常接近。與此相吻合的是，從最近發(fā)表的氯霉素乙酰基轉移酶的晶體結構可以看出，這兩個突變位點并非處于酶活性中心。通過構建自殺質粒、定點突變和遺傳互補獲得了catB7基因含有181A/G或314A/G單點突變的銅綠假單胞菌衍生菌株PAcr181和PAcr314。氯霉素敏感性